复方肉苁蓉酒提取工艺的优化

郭小莉， 高如意， 许明君， 刘文英， 柏伟荣

(江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001)

复方肉苁蓉保健酒由管花肉苁蓉、红景天、西洋参、枸杞4味中药组成。方中肉苁蓉补肾气，养精血；红景天补气健脾；西洋参补气养阴，清热生津，加强红景天益气之功；佐以补肝肾益精血之枸杞，诸药合用，平补阴阳，调养五脏，温而不燥，补而不腻，无阴阳偏盛之弊，共奏补肾填精益气之功效，具有缓解体力疲劳、增强免疫力的双重保健功效。

保健酒是指以酿造酒、蒸馏酒或食用酒精为酒基，以中药材为原材料，利用萃取、浸提等技术，得到中药有效成份进而配制所得的具有一定保健功能的本品[1]，它是否具有保健功能，中药材有效成分的提取是关键。本实验以复方肉苁蓉保健酒中君药肉苁蓉[2]的功效成分松果菊苷、毛蕊花糖苷，红景天中红景天苷及产品中总皂苷为指标，采用层次分析法(AHP)结合CRITIC法计算权重系数，求出综合评分，正交试验优化该方提取工艺，以期在保证其功效的基础上为后续相关开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；LC-20AT液相色谱仪、UV-2700型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；XP6、MS-105DU电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试剂与药物 松果菊苷(纯度89.7%，批号111670-201706)、毛蕊花糖苷(纯度92.5%，批号111530-201713)、红景天苷(纯度98.8%，批号110818-201709)、人参皂苷Re(纯度97.4%，110754-201626)对照品均购自中国食品药品检定研究院。管花肉苁蓉购自新疆北达苁蓉生物科技有限公司，红景天购自亳州市国一堂中药饮片有限公司，西洋参购自云南白药文山七花有限责任公司，枸杞购自江苏国苏中药材有限公司，经检验均符合2015年版《中国药典》一部规定。乙腈、甲醇为色谱纯，购自美国天地公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 松果菊苷、毛蕊花糖苷含量测定 参考文献[3-4]报道。

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取对照品适量，置于棕色量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，即得(松果菊苷、毛蕊花糖苷质量浓度分别为1.676 5、0.629 mg/mL)。

2.1.2 供试品溶液制备 精密量取本品1 mL至2 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，超声处理15 min，50%甲醇定容至刻度，离心，取上清液，即得。

2.1.3 色谱条件 Intersustain Swift C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～30 min，15%～27%A；30～40 min，27%A)；体积流量1.0 mL/min；检测波长330 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.松果菊苷 2.毛蕊花糖苷图1 松果菊苷、毛蕊花糖苷HPLC色谱图

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液5 mL，置于10 mL棕色量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，逐级稀释，分别吸取10 μL，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程分别为松果菊苷Y=12 282 607.55X+429 234.77(R2=0.999 2)，线性范围0.052 4～1.676 5 mg/mL；毛蕊花糖苷Y=16 956 179.10X+64 108.76(R2=0.999 5)，线性范围0.019 7～0.629 0 mg/mL。

2.1.5 精密度试验 取供试品溶液及“2.1.4”项下对照品溶液DZ1、DZ4、DZ6，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6次，测得DZ1、DZ4、DZ6中松果菊苷峰面积RSD分别为0.23%、0.44%、0.31%，毛蕊花糖苷分别为0.44%、0.54%、0.52%，而供试品溶液中两者峰面积RSD分别为0.10%、0.16%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取“2.1.4”项下对照品溶液DZ4及供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得2种溶液中松果菊苷峰面积RSD分别为0.76%、0.23%，毛蕊花糖苷分别为1.42%、0.18%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取本品适量，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得松果菊苷、毛蕊花糖苷含量RSD分别为1.45%、1.40%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 按照供试品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的100%水平，取对照品溶液适量于2 mL棕色量瓶中，氮吹至干，加入本品0.5 mL，平行6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，松果菊苷、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为100.32%、99.42%，RSD分别为1.70%、1.85%。

2.2 红景天苷含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取红景天苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.852 mg该成分的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取本品1 mL，置于2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，超声处理20 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.3 色谱条件 参考文献[5-6]报道。Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；体积流量1 mL/min；流动相乙腈(A)-0.3%磷酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，3%～5%A；20～40 min，5%A)；柱温35 ℃；检测波长275 nm；进样量5 μL。色谱图见图2。

1. 红景天苷图2 红景天苷HPLC色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，甲醇逐级稀释并定容至刻度，分别吸取5 μL，注入高效液相色谱仪，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=10 534 278.65X+334 643.51(R2=0.999 8)，线性范围0.027～0.852 mg/mL。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.4”项下同一份对照品、供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得2种溶液中红景天苷峰面积RSD分别为0.57%、0.98%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.4”项下同一份对照品、供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、20、24 h在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得2种溶液中红景天苷峰面积RSD分别为0.49%、1.05%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取本品适量，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得红景天苷含量RSD为1.45%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 按照供试品溶液中红景天苷含量的100%水平，取对照品溶液(0.419 1 mg/mL)0.2 mL，置于2 mL棕色量瓶中，加入本品0.5 mL，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，红景天苷平均加样回收率为101.48%，RSD<3%。

2.3 总皂苷含量测定 参考文献[7]报道。

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Re对照品适量，甲醇制成每1 mL含2 mg该成分的溶液，摇匀，即得。取100 μL至蒸发皿中，置于60 ℃水浴中挥干，加1 mL纯化水溶解，10 mL注射器作为层析柱，内装3 cm AmerLite-XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。先用25 mL 70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，将1.0 mL对照品溶液加入层析柱中，先用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60 ℃水浴再挥干，用于显色。

2.3.2 供试品溶液制备 取本品适量，离心，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，37%乙醇定容至刻度，摇匀，吸取1 mL，置于水浴中挥干，1 mL水溶解残渣，进行柱层析，以下操作同“2.3.1”项。

2.3.3 吸光度测定 在已挥干的对照品、供试品溶液中精密加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，残渣溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后移入10 mL比色管中，60 ℃水浴加热10 min，取出，冰浴冷却，精密加入5.0 mL冰乙酸，摇匀，在560 nm波长处测定吸光度。

2.4 正交试验 在前期单因素试验基础上，并结合《保健食品注册与备案管理办法》中关于保健酒的酒精度数和食用量的规定，以松果菊苷+毛蕊花糖苷、红景天苷、总皂苷量为评价指标，浸提时间(A)、基酒度数(B)、基酒倍数(C)为影响因素，采用L9(34)正交试验优化提取工艺，计算综合评分Y，公式为Y=(松果菊苷+毛蕊花糖苷总量/最高总量×权重系数+红景天苷含量/最高含量×权重系数+总皂苷含量/最高含量×权重系数)×100，L9(34)正交试验优化提取工艺，结果见表1。

表1 试验设计与结果

2.5 权重系数确定

2.5.1 AHP法 根据复方中药保健酒中君臣佐使的配伍，以及各指标成分对缓解体力疲劳、增强免疫力直接作用的强弱程度，采用 1～9 标度法[8-11]对3个影响因素进行两两比较以评判重要性，判断标准见表2，最终将各指标成分作为权重指标予以量化，判断优先矩阵表见表3。按照方根法计算各个指标的初始权重系数(Wi′)，算数平均法计算归一化权重系数(Wi)，得到松果菊苷+毛蕊花糖苷总量、总皂苷、红景天苷权重系数分别为0.625 0、0.238 5、0.136 5，再对其进行一致性检验，测得一致性指标CI为0.009，平均随机一致性指标RI为0.58，一致性比率CR(CI/RI)为0.02<0.10，表明各指标的判断矩阵排序满足一致性要求，设计合理，权重系数有效。

表2 判断矩阵标度定义

表3 指标成对比较的判断矩阵及其权重系数

2.5.2 CRITIC法 CRITIC法[12-14]是一种客观权重赋权法，它以2个基本概念为基础，一是对比强度，以标准差的形式来表现；二是评价指标之间的冲突性，以指标之间的相关性为基础，故该方法是基于评价指标的对比强度和指标之间的冲突性来综合衡量指标的客观权重，在考虑指标变异性大小的同时兼顾指标之间的相关性，完全利用数据自身的客观属性进行科学评价。本实验将表1数据进行无量纲化处理，即指标成分=(实测值-最小值)/(最大值-最小值)，利用MATLAB 7.11(R2010b)软件将标准化数据进行相关系数运算，得到3×3相关系数矩阵(Z)，通过公式Cj、Wj得到松果菊苷+毛蕊花糖苷、红景天苷、总皂苷指标权重系数分别为0.290 4、0.260 4、0.449 3。具体如下。

2.5.3 AHP-CRITIC混合加权法 AHP法量化了评价指标两两比较判断的优先信息，主观评价了各指标的权重系数，可体现配方中各药味君臣佐使的配伍原则；CRITIC法利用对比强度和冲突性来综合客观地评价指标成分的权重系数，故实验将这2种评价方法相结合，兼顾主观评价和客观权衡，使得权重系数的确定更科学合理。计算公式为ω综合=ωAHPωCRITIC/∑ωAHPωCRITIC[15]，其中ωAHP为通过AHP法确定的权重系数，ωCRITIC为通过CRITIC法确定的权重系数，测得松果菊苷+毛蕊花糖苷、红景天苷、总皂苷权重系数分别为0.559 9、0.109 6、0.330 5。

2.5.4 综合评价结果比较 分别采用AHP法、CRITIC法、AHP-CRITIC混合加权法对正交试验结果进行综合评价，结果见表4，可知3种赋权法所得综合评分相差不大。利用MATLAB 7.11(R2010b)软件对评分结果进行相关系数分析，测得AHP法与AHP-CRITIC法之间的相关系数为0.998 9，CRITIC法与AHP-CRITIC法之间的相关系数为0.987 2，AHP法与CRITIC法之间的相关系数为0.988 8，均有显著差异(P<0.05)；对权重系数进行分析，测得AHP法与CRITIC法之间的相关系数为-0.174 7，无显著差异(P>0.05)，表明AHP法和CRITIC法所展示的信息无叠加性，故AHP-CRITIC混合加权法计算权重系数时更科学合理。

表4 3种赋权方法综合评分(分)

2.6 工艺确定 对AHP-CRITIC混合加权法所得综合评分进行方差分析，结果见表5，可知因素C有显著影响(P<0.05)，而B、C不显著(P>0.05)。最终确定，最优工艺为A2B2C2，即浸提时间42 d，基酒度数60%，基酒倍数8倍。

表5 方差分析

2.7 验证试验 按“2.6”项下优化工艺进行3批验证试验，结果见表6。由此可知，各指标成分含量和综合评分RSD均小于3%，表明该工艺稳定可行。

表6 验证试验结果(n=3)

3 讨论

3.1 指标成分含量测定 本实验在测定复方肉苁蓉酒中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量时，参考2015年版《中国药典》肉苁蓉药材项下含量测定方法，但发现30 min内色谱峰出峰不完全，故通过调整甲醇比例及梯度洗脱时间使上述2种成分的色谱峰均能在期间出峰，表示分离度符合药典要求，阴性样品无干扰，专属性良好；在测定红景天苷含量时对色谱条件进行筛选，发现采用2015年版《中国药典》红景天药材项下含量测定方法、2003年版《保健食品检验与评价技术规范》红景天苷测定方法时，阴性样品均有干扰，分离度不理想，故参照相关文献对红景天苷进行改进，发现所得色谱条件适用于本品中红景天苷含量的测定。再对柱温、体积流量、仪器、色谱柱等进行考察，发现该方法耐用性良好，分离度大于1.5，拖尾因子大于0.95，阴性样品无干扰。

3.2 指标成分权重确立 在综合评价中，常用的权重系数确定方法为熵权法、层次分析法(AHP)、CRITIC法、标准离差法等，而本实验涉及到AHP法、CRITIC法、AHP-CRITIC混合加权法。复方肉苁蓉酒作为复方中药保健酒，AHP法可充分体现其组方的君臣佐使配伍原则，但将各成分作为权重指标予以量化时，其判断优先评价标度容易受到操作者主观判断的影响；CRITIC法利用评价指标的对比强度和冲突性来综合衡量指标的客观权重，但容易忽略产品中主要药味、主要指标成分对产其功效的贡献率。因此，本实验采用AHP-CRITIC混合加权法对正交试验结果进行分析，并进行3批验证试验，发现所得结果接近，表明该方法所优化的工艺稳定可靠，可为复方肉苁蓉酒后续工业化生产及成品质量控制提供参考依据。