显微红外光谱法联合其他手段剖析6批问题清火片的造假本质

艾 芸， 许苗苗， 张 楠， 李 媛， 张 鑫， 王舒懿， 谢志民

(西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054)

清火片是一种常用的清火解毒类中药制剂，具有清热泻火、通便之功效，用于治疗咽喉肿痛、牙痛、头目眩晕、口鼻生疮、风火目赤、大便不通[1]，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二册[2]，由大黄、石膏、薄荷脑、大青叶组成，该制剂生产工艺中除了大青叶煎煮浓缩外，其余3味中药均以粉末形式参与入药。西安市食品药品检验所在承担2018年国家药品评价性抽验检验过程中发现，某生产企业生产的6批清火片在显微镜下可见大量不应有的矿物碎块，为了确定其性质，本实验进行了显微红外光谱鉴定、总灰分检查、酸不溶性灰分检查、铝元素含量测定、有机染料检查，揭示了其造假本质。

显微红外光谱法是将显微镜技术应用到红外光谱仪中，并将显微镜的直观成像和红外光谱的官能团化学分析相结合，不仅能对物体进行形貌成像，而且还可提供物体空间各个点的光谱信息[3]，作为将光谱分析和图像技术相结合的一种新型技术，它具有高精度、高灵敏度、快速、无损、可视化和无污染等优点，能选择样品的不同部位的红外光谱图像进行分析，从而得到测量位置处物质的分子结构、官能团等信息，是了解未知物质分子组成的强有力的方法[4-5]。因此，本实验采用该方法对6批问题清火片进行研究。

1 材料

1.1 仪器 IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪、AIM-9000红外显微镜、UHPLC Nexera X2系列超高效液相色谱仪(配置8060三重四级杆串联质谱仪)、LC2010AHT高效液相色谱仪(配置DAD检测器)(日本Shimadzu公司)；iCAP 7000电感耦合等离子体发射光谱仪(美国Thermo公司)；Ethos-One微波消解仪(意大利Milestone公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 试剂与药物 亮蓝(批号112010-201501，中国食品药品检定研究院)；铝标准溶液(1 000 μg/mL，GSB04-1713-2004，国家有色金属及电子材料分析测试中心)。清火片(批号161002、170301、170401、170402、170501、180401，国内某生产企业)。硝酸为优级纯(德国Merck公司)；氢氟酸为UP级(苏州晶瑞化学股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取本品粉末适量，用稀甘油装片后在显微镜下观察，发现无机结晶团块众多，透明或半透明；淡蓝色碎块棱角明显，边缘黑色，表面可见蓝黑色色素颗粒；水合氯醛透化后，可见小圆洞或裂隙；大黄的特征稀少，零星可见糊化淀粉粒团块和草酸钙簇晶。见图1。

图1 6批样品显微特征图

2.2 矿物碎块性质确定

2.2.1 总灰分 取本品10片，除去糖衣，称定质量，计算片芯平均质量，研细，取约2 g，精密称定，按照灰分测定法[6]测定，结果见表1。按照质量标准处方和制法，本品每片含大黄100 mg、石膏50 mg、薄荷脑6.5 mg、大青叶400 mg(煎煮)；企业操作规程显示，本品每片加淀粉75 mg。大黄总灰分按10%(药典规定限度)计算，大青叶出膏率按5%计算，石膏(CaSO4·2H2O)含水量按19%计算，则本品每片含非灰分200 mg，最大总灰分分别为平均片重的16.04%(161002)、15.50%(170301)、14.16%(170401)、18.57%(170402)、14.46%(170501)、16.60%(180401)，测定结果分别超出52.76%(161002)、61.58%(170301)、63.62%(170401)、60.90%(170402)、63.08%(170501)、60.60%(180401)，表明该企业在生产时非法添加了52.8%～63.6%以上无机矿物质，与显微镜下观察到的大量无机结晶碎块一致。

表1 6批样品片芯中总灰分、酸不溶性灰分、铝含量测定结果

2.2.2 显微红外光谱 将本品除去糖衣，研细，取少量粉末平铺于铝镜上，显微镜下选择边缘显蓝黑色的无机团块，在4 000～400 cm-1范围内反射法测定吸光度(检测器MCT；分辨率8 cm-1；扫描次数50次；动镜速度20；变迹函数Sqr Triangle)，并与标准谱库进行比较，发现批号161002、170301、170401、170402、170501均易检出无机颜料群青蓝(Na6Al6Si6O24S4)，而批号180401由于其他物质干扰导致其检出稍难，见图2～3。

图2 蓝色碎块显微图谱

图3 蓝色碎块红外图谱

2.2.3 酸不溶性灰分 取上述总灰分，按照灰分测定法[6]测定，结果见表1。由此可知，企业非法添加的无机矿物质主要是硅酸盐类化合物，印证了显微红外光谱结果。

2.2.4 铝含量测定 取本品粉末约0.1 g，精密称定，置于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入硝酸8 mL、双氧水4 mL、氢氟酸2 mL，浸泡4 h，置于微波炉内中，赶酸至消解液剩余2～3 mL，加水定容至25 mL聚乙烯塑料量瓶中，作为供试品溶液。同法制备空白溶液。

采用电感耦合等离子发射光谱法测定[6](检测波长396.152 nm；RF发射功率1 150 W；蠕动泵转速50 r/min；辅助气体积流量0.5 L/min；载气体积流量0.70 L/min；冷却气体积流量12.0 L/min；载气压力0.6 MPa；冲洗时间30 s；重复测定3次；铝标准溶液0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、8.0 μg/mL，回归方程Y=10 080X，r=0.999 9)，结果见表1，印证了显微红外光谱结果。

2.3 亮蓝检查

2.3.1 TLC法 取本品5片，除去包衣，研细，加10 mL甲醇超声处理20 min，取出，3 000 r/min离心5 min，取上清液，作为供试品溶液；另取亮蓝对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法[6]，吸取上述2种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-无水乙醇-浓氨-水(2∶12∶2.6∶0.6∶2.8)为展开剂，展开，取出，晾干，结果见图4。由此可知，6批样品TLC色谱图中均有与亮蓝对照品对应的斑点。

1.161002 2.170401 3.170402 4.170301 5.1705016.180401. 7.亮蓝对照品图4 亮蓝TLC色谱图

2.3.2 HPLC-DAD法分析

2.3.2.1 色谱条件与系统适用性试验 流动相甲醇(A)-0.02 mol/L乙酸铵(B)，梯度洗脱，程序见表2；体积流量1.0 mL/min；DAD检测器，检测波长254 nm。理论塔板数按亮蓝峰计，不低于5 000。

表2 梯度洗脱程序

2.3.2.2 对照品溶液制备 取“2.3.1”项下对照品溶液，甲醇制成每1 mL含20 μg该成分的溶液，即得。

2.3.2.3 供试品溶液制备 取“2.3.1”项下供试品、对照品溶液，点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-无水乙醇-浓氨-水(2∶12∶2.6∶0.6∶2.8)为展开剂，展开，取出，晾干，刮取样品中亮蓝对应的条斑，加5 mL甲醇溶解，离心，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.2.4 色谱分析 精密吸取“2.3.2.2”项下对照品溶液、“2.3.2.3”项下供试品溶液各20 μL，在“2.3.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图5。由此可知，6批样品在亮蓝对照品色谱图相应位置上均显示相同紫外吸收的色谱峰。

1.亮蓝图5 亮蓝HPLC-DAD色谱图

2.3.3UHPLC-MS/MS法

2.3.3.1色谱条件Shim-packGISTC18色谱柱(100mm×2.1mm，2μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～3min，10%～25%A；3～12.5min，25%～98%A；12.5～13min，98%～10%A)；体积流量0.4mL/min；柱温30℃；进样量2μL。色谱图见图6。

图6 亮蓝总离子流图及二级质谱图

2.3.3.2质谱条件ESI正离子源，温度300℃；脱溶剂管温度250℃；加热块温度400℃；雾化气体积流量3.0L/min；加热气体积流量10.0L/min；干燥气体积流量10.0L/min；采用多反应监测(MRM)模式测定，m/z793.20～623.15,713.15；碰撞电压-45、-39eV。

2.3.3.3对照品溶液制备 取“2.3.2.2”项下对照品溶液，加甲醇制成每1mL含100ng该成分的溶液，即得。

2.3.3.4供试品溶液制备 精密吸取“2.3.2.3”项下供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3.5色谱分析 精密吸取“2.3.3.3”项下对照品溶液、“2.3.3.4”项下供试品溶液各2μL，在“2.3.3.1”和“2.3.3.2”项条件下进样测定，结果见图6。由此可知，6批样品色谱图中均出现与亮蓝对照品色谱保留时间一致的色谱峰。

3 讨论

6批涉嫌掺假清火片总灰分、酸不溶性灰分分别为68.8%～79.5%、52.5%～62.2%，表明企业可能非法添加了硅酸盐类无机矿物质，显微红外光谱法进一步检查结果显示，推测此无机矿物为染料群青蓝(Na6Al6Si6O24S4)。再采用ICP-OES法测定元素含量，发现铝含量较高，由于铝并非人体所必需的元素[7]，摄入后很难被代谢，当蓄积量超出人体所能承受的范围后会导致中枢神经紊乱，影响智力发育和骨骼病变[8-10]。我国对于不同类型食品中铝添加剂的使用进行了明确规定，例如国家标准GB 2760-2014要求面制品中铝的残留量≤100 mg/kg[11]。

近年来，中药外源性有害物质残留越来越受到关注[12-14]。本实验发现，6批问题清火片中铝含量高达296.38～2 135.78 mg/kg，严重超出了正常限量，需引起关注，同时TLC、HPLC-DAD、UHPLC-MS/MS检查结果显示，里面还非法添加了有机染料亮蓝。由此可知，它们均为造假产品，已建议对涉嫌造假的企业进行飞行检查，严肃处理，国家药品监督管理局也已要求当地药品监管部门控制其销售。另外，清火片现行质量标准已不能有效控制药物质量，故建议对其进行补充完善，以期保证用药有效性和安全性。