基于生物信息学和网络药理学研究独活寄生汤治疗绝经后骨质疏松症的分子机制

管世兵， 陈春燕， 涂 楚， 陆忠杰*

(1.六安市中医院药剂科，安徽 六安 237006；2.六安市中医院心病科，安徽 六安 237006)

绝经后会造成女性卵巢肺功能衰退，体内雌性激素水平显著下降，导致谷歌效应障碍最终诱发骨质疏松症的发生[1]。研究表明，此类患者多以骨量减少，骨脆度增加，外界轻微外力可引发骨折，严重的影响了患者的生活质量[2]。因此，通过积极探寻有效药物治疗显得尤为关键。独活寄生汤出自《备急千金要方》，长期应用骨关节炎治疗，能够有效缓解膝关节炎临床症状[3]。新进研究发现，独活寄生汤也能够改善骨质疏松症患者临床症状，提高患者的生活质量[4]。但是目前有关独活寄生汤对绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的作用机制尚不清楚。因此本研究基于网络药理学和生物信息学手段探究独活寄生汤对PMOP的分子作用机制，为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雌性SD大鼠30只，6～8周龄，由安徽医科大学动物实验中心提供,动物生产许可证号 SCXK(皖)2017-001，饲养条件相对湿度50%～70%，12 h/12 h交替光照，实验期间均正常饮食饮水。

1.1.2 试剂与药物 独活寄生汤购于安徽中医药大学附属第一医院，由独活(9 g)、桑寄生(6 g)、牛膝(6 g)、杜仲(6 g)、秦艽(6 g)、防风(6 g)、肉桂(6 g)、细辛(6 g)、川芎(6 g)、当归(6 g)、芍药(6 g)、干地黄(6 g)、人参(6 g)、茯苓(6 g)、甘草(6 g)组成，生药量为2.269 g/mL；BCA试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)；caspase-3抗体、Bcl-2(美国CST公司)；p53、p21抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；GAPDH抗体、一抗、二抗稀释液(江苏碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 仪器 双能X射线骨密度仪小动物专用扫描和分析软件(美国Hologic公司)；MTS-858miniBionix生物材料力学试验机(美国MTS公司)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 独活寄生汤活性化合物成分筛选和靶点预测 在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)中检索独活寄生汤各味中药的所有化合物成分，并根据成分毒物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)参数进一步对潜在有效化合物进行筛选，筛选条件为：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18。利用TCMSP数据库中靶点预测模型预测所筛选出化合物的潜在作用靶点。

1.2.2 GEO芯片数据分析PMOP相关靶点 本研究从Gene Expression Omnibus数据库中下载编号为“GSE56116”的芯片数据，该芯片数据的原始文件将10例绝经后骨质疏松患者作为观察组，另取3例健康绝经后女性作为对照组，对所有患者的基因表达谱进行测序，并寻找两组间基因表达差异。所有血液样本全部采用“GPL4133”平台进行检测。本研究采用R语言及limma等软件包对基因芯片数据进行分析，默认参数设置来鉴别相关差异表达基因，以 log FC与P值为筛选条件，筛选标准为|log FC|>1、P<0.05，所筛选出的基因被视为显著差异表达基因。

1.2.3 独活寄生汤治疗关键靶点筛选及其蛋白质相互关系网络构建 采用Perl语言脚本对筛选出的独活寄生汤活性成分潜在靶点和PMOP相关靶点取交集，得到共同靶点；采用Cytoscape 3.7.2软件中的BisoGenet插件绘制上述靶点的调控网络，在网络图形中用“节点”(node)表示化合物分子，“边”(edge)表示化合物分子与靶点之间的关系；最后采用Cyot NCA插件进一步对调控网络进行拓扑分析。

1.2.4 基因本体(GO) 功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG) 通路富集分析 本研究采用R语言及相关功能程序包进行GO和KEGG分析。对上述独活寄生汤活性成分靶点和SARS-CoV感染性肺炎相关靶点取交集后，将所得的靶点进行ID转换，即使用R语言将靶点转化为可识别的entrez ID；在R语言中调用相关生物类程序包，如clusterProfiler、BiocManager、enrichplot等进行数据处理；调用R语言中数据可视化程序包，如ggplot等绘制GO和KEGG富集分析的条形图。

1.2.5 分组、造模及给药 雌性SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组，模型组和独活寄生汤组，每组各10只。模型组和独活寄生汤组大鼠采用背侧入路双侧卵巢切除法造模，假手术组切除双侧卵巢旁脂肪组织，手术后7 d，期间对大鼠采用青霉素肌肉注射，预防切口感染。独活寄生汤组大鼠按照10 mL/(kg·d)剂量进行灌胃，实验组根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算，按照9.3 g/(kg·d)剂量进行灌胃，连续治疗12周。手术后12周，3组大鼠进行腰椎骨密度检测。

1.2.6 骨密度检测 大鼠麻醉后取仰卧位，采用双能X射线对大鼠全身进行扫描，设定腰椎为感兴趣区域，最后通过仪器相关软件进行腰椎骨密度分析。

1.2.7 大鼠骨生物力学检测 实验检测前12 h，从冷冻冰箱内取出L4椎体，去除椎间盘、附件、终板，利用砂纸打磨椎体上下两端以保证两面的水平，放置于室温条件下解冻，MTS法进行腰椎压缩实验。根据实验仪器相关软件进行数据分析得到各组大鼠腰椎刚度和最大载荷。

1.2.8 Western blot实验 (1)取大鼠胫骨近端骨组织约150 mg，剪碎后放置于1.5 mL的组织研磨管内并按照1∶2～1∶3比例加入组织裂解液放置在已经预冷后的组织匀浆仪中进行研磨；(2)高速离心机4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集骨组织上清液，采用BCA法进行蛋白质浓度定量检测；(3)按照每孔上样量为30 μg进行蛋白质凝胶电泳实验，电泳转膜后牛奶封闭时间约2 h，孵育对应caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶500)、p21(1∶500)和GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于摇床摇晃洗膜，含吐温磷酸盐缓冲液洗涤后加入发光聚合物，使用胶片曝光，图片扫描后用 Image J 软件计算各条带的灰度值，以各目标条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 独活寄生汤活性成分筛选、ADME分析及靶点预测 通过检索TCMSP数据库，共计检索独活寄生汤中茯苓、甘草、秦艽、白头翁、大枣、黄连、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黄芩、黄柏、党参、人参、干姜、防风、白术、独活、桑寄生、半夏、川芎、当归、细辛24味中药共计2 733种相关成分及其ADME参数。根据OB、DL参数共筛选出符合标准的活性成分334个，见图1。独活寄生汤中各味中药活性成分OB≥30%、DL≥0.18的比例见图2。利用TCMSP数据库靶点预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复的后共获得潜在作用靶点313个。

图1 符合OB≥30%、DL≥0.18筛选标准的化合物数量

图2 各味中药活性成分符合OB≥30%、DL≥0.18的比例

2.2 PMOP相关靶点基因及其差异分析 进一步挖掘GSE56116芯片数据原始文件中的相关数据，共获取健康受试者、PMOP患者间明显改变的基因共971个，其中在PMOP患者中表达上调的541个，表达下调的430个，差异基因表达热图、火山图见图3～4。

图3 差异表达基因热图

图4 差异基因表达火山图

2.3 独活寄生汤治疗PMOP的PPI网络构建 将“2.1”项下获得的独活寄生汤有效成分潜在作用靶点与“2.2”项下获得的PMOP相关差异基因靶点取交集共得到独活寄生汤治疗PMOP关键靶点19个。采用Cytoscape软件建立独活寄生汤中药调控网络，如图2所示，共获得134个节点和157个关系，半夏中的MOL002714，藿香中的MOL005916、甘草中的MOL004835及柴胡、款冬花、甘草、藿香、麻黄及紫菀中的共有成分MOL000098等有效成分与网络中的多个靶点存在相互作用，而GSK3B、NCOA1及CA2等靶点也能作用于多个有效成分，见图5。

图5 独活寄生汤治疗PMOP的基因调控网络图

为进一步获得更多节点的传递信息和更高的节点信息传递效率，本研究采用Cytoscape软件中的BiosGenet和CytoNCA插件，于DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT和BIND数据库种建立独活寄生汤治疗PMOP的19个关键靶点的蛋白质相互作用网络，并对网络节点的拓扑属性进行了分析筛选，共发现关键节点161个，筛选策略示意图见图6。

图6 独活寄生汤关键节点的目标帅选策略图

2.4 GO、KEGG富集分析 利用R软件及相关程序包对独活寄生汤治疗PMOP的19个键靶点进行GO和KEGG富集分析，将GO富集过程中的分子生物学过程、分子功能及细胞成分和KEGG通路按照P值升序排列，分别取前20、25位进行分析，若未满20或25个则全部纳入分析，结果见图7～8和表1。由图7可知，独活寄生汤治疗PMOP关键靶点涉及的生物学过程主要包括response to xenobiotic stimulus、xenobiotic metabolic process、sterol metabolic process等，分子功能主要包括glutathione binding、oligopeptide binding、cofactor binding等，细胞成分主要包括intercellular bridge、sarcoplasmic reticulum、sarcoplasm等；由表1、图8可知，独活寄生汤治疗PMOP的主要信号通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450(hsa00980)、Leishmaniasis(hsa05140)等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL4、FOS是各通路主要的富集基因。

注：柱状图长度代表基因富集个数，颜色深度代表P值。图7 独活寄生汤治疗PMOP的GO富集柱状图

图8 独活寄生汤治疗PMOP的KEGG关系网络图

表1 独活寄生汤治疗PMOP的KEGG分析

2.5 独活寄生汤对大鼠骨密度和生物学力的影响 表2显示，独活寄生汤灌胃处理12周后，与假手术组比较，模型组大鼠骨密度、刚度、最大载荷均降低(P<0.01)；与模型组比较，独活寄生汤组大鼠骨密度、刚度和最大载荷均升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 独活寄生汤对大鼠骨密度和生物学力的影响

2.6 独活寄生汤对p53信号通路相关蛋白表达影响 图9～10显示，P53信号通路相关蛋白主要涉及p53、p21以及相关凋亡蛋白(caspase-3和Bcl-2)；与假手术组比较，模型组caspase-3表达升高(P<0.01)，Bcl-2表达降低(P<0.01)，p53和p21蛋白表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，独活寄生汤药物干预组caspase-3表达降低(P<0.01)，Bcl-2表达升高(P<0.05)，p53和p21蛋白表达均降低(P<0.05)。

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图9 独活寄生汤对caspase-3、Bcl-2表达的影响

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。图10 独活寄生汤对p53、p21表达的影响

3 讨论

独活寄生汤是由独活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草组成。其中方剂中的独活具有祛下焦风寒湿邪，为君药。秦艽、防风祛风胜湿；肉桂温里祛寒，通利血脉；细辛祛寒止痛，均为臣药。桑寄生、牛膝、杜仲、芍药补益肝肾，强壮筋骨；甘草调和诸药，为使药。诸药合用，祛邪扶正，标本兼顾，达到祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效。当归、川芎、干地黄养血活血；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气，均为佐药[5-7]。既往研究发现独活寄生汤能够通过调控骨保护蛋白以及核因子-κB受体活化自配体和核因子-κB受体活化因子，从而调节骨吸收和骨重建等[8-9]。绝经后骨质疏松是女性绝经后的一种常见性骨骼疾病，是一种以骨密度低、骨组织微结构损伤，导致的骨脆性增加，最终易于发生骨折为特点的全身性骨病[10]。临床试验研究表明，独活寄生汤能够一定程度上改善骨质疏松患者的临床症状增加骨密度[11]。但是目前有关于独活寄生汤对PMOP的分子作用机制尚不完全清楚。因此，本研究通过网络药理学与生物信息学联合筛查独活寄生汤对PMOP的分子作用机制。

通过检索TCMSP数据库，共计检索独活寄生汤中茯苓、甘草、秦艽、白头翁、大枣、黄连、杜仲、川牛膝、熟地、秦皮、赤芍、黄芩、黄柏、党参、人参、干姜、防风、白术、独活、桑寄生、半夏、川芎、当归、细辛24味中药并按照独活寄生汤中各味中药活性成分OB≥30%和DL≥0.18筛选得到有效活性化合物334中，涉及相关靶基因313个。进一步，通过生物信息学和GeneCards筛选得到PMOP患者差异表达基因971个，上调的基因541个，表达下调的基因430个。将独活寄生汤涉及相关基因与PMOP有关基因取交集得到19个可能参与独活寄生汤治疗PMOP。最后对相关基因与有效活性化合物进行Cytoscape软件处理得到134个节点和157条边。以上筛查结果表明，独活寄生汤治疗PMOP具有多成分多靶点的特点。最后，通过GO功能和KEGG通络富集分析得到独活寄生汤治疗PMOP的主要信号通路包括Fluid shear stress and atherosclerosis(hsa05418)、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、p53signaling pathway等，而GSTM1、GSTM2、CCND1、CD40LG、IL-4及 FOS是各通路主要的富集基因。p53信号通路广泛涉及细胞增殖、凋亡等生物学过程。其中p53 是一种抑癌基因，其在细胞衰老中发挥重要作用。研究证实，p53能够通过作用细胞有丝分裂进而影响p53和p21基因，激活相关基因表达，最终引起细胞复制性衰老[12-15]。细胞凋亡是机体的一种正常生理学过程，其是以caspase-3活化继而诱导细胞凋亡小体形成最终被吞噬细胞吞噬处理[16]。以往研究均已证实，棕榈酸能够通过活化p53/p21信号诱导骨骼肌细胞衰老，同时上调caspase-3，下调Bcl-2诱导细胞凋亡增加，导致肌少症[17-18]。另外研究表明，在骨质疏松症大鼠模型中，p53和p21表达均显著上调，给予槲皮素后能够调控p53/p21途径，抑制骨细胞样细胞衰老，挽救雌激素缺乏导致的骨丢失[19]。以上研究均表明，p53信号通路在骨质疏松症中发挥重要作用。因此，本研究通过构建PMOP大鼠模型探究独活寄生汤能否通过p53信号途径改善PMOP。结果发现，与假手术组比较，模型组大鼠骨密度、刚度和最大载荷均降低。与模型组比较，给予独活寄生汤能够升高骨密度、刚度和最大载荷。以上研究结果表明，独活寄生汤能够改善PMOP。为进一步探究相关分子作用机制，通过Western blot检测凋亡相关蛋白以及p53和p21表达。与假手术组比较，模型组caspase-3表达升高，Bcl-2表达降低，p53和p21蛋白表达均升高。与模型组比较，独活寄生汤药物干预组caspase-3表达降低，Bcl-2表达升高，p53和p21蛋白表达均降低。

综上所述，独活寄生汤治疗PMOP具有多成分多靶点特性，其可能通过p53信号通路抑制细胞凋亡和衰老改善PMOP临床症状。以上研究为独活寄生汤治疗PMOP提供了新的理论依据。