膝骨关节炎中医证候动物模型的研究进展

杨威 郭斯印 易志勇

【摘 要】 膝骨关节炎基本中医证型是肾阳虚证、气滞血瘀证和寒湿阻滞证，中医证候动物模型以肾阳虚模型、血瘀模型和寒湿模型为主。肾阳虚证模型是研究最早的中医证候动物模型，造模方法种类繁多，包括西医病理造模和中医病因造模，但两者都存在不足，所以病证结合模型备受关注。科学评价病证结合模型，应采集动物“四诊信息”，结合基因组学、代谢组学和蛋白组学等，宏观微观综合评价，必要时运用经典方剂佐证。

【关键词】 膝骨关节炎;动物模型;中医证型;病证结合;研究进展;综述

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性进行性骨关节疾病，基本病理改变为软骨变性和丢失、滑膜肥厚及关节边缘和软骨下骨质再生，多发于膝称为膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）[1-3]。

随着人民生活水平的提高，预期寿命的延长，KOA的发病率逐年增高[4]，国外也有相关报道[5]。KOA临床表现为慢性关节活动痛、僵硬，严重者关节畸形甚至瘫痪，尽管最新临床和实验研究认为未变性的Ⅱ型胶原有利于KOA患者[6]，但目前病因病机不明，仍缺乏有效的治疗手段[3，7]。而动物实验是人们深入认识KOA发病机制和探索有效治疗手段的重要途径[8-11]。

中医药通过减轻KOA患者疼痛、改善关节功能和调节整体生理功能进而提高患者生活质量。KOA属中医学“膝痹”范畴，病因病机为“本痿标痹、本虚标实”。肝肾亏虚，筋骨失养为本痿;邪气痹阻，经络不畅为标痹[12-13]。本病大致可分为气滞血瘀证、寒湿痹阻证和肝肾亏虚证，分别对应血瘀、寒湿和肾阳虚型造模。为进一步探究其发病机制，就此做一简要综述。

1 动物的选择

OA的动物造模，最常复制膝关节，还包括髋关节、掌指关节和颞下颌关节[14]等。按照体积大小可以将KOA模型动物分为小型、较大型和灵长类，小型动物包括鼠类和兔等，大型动物包括羊、小猪和马等，灵长类动物有狒狒、猕猴和黑猩猩等。动物的选择应当考虑以下几点因素：实验目的、类型、时间长短、饲养花费、操作难易和结果检测等。时间长短要考虑每种动物骨骼成熟时间和发展为KOA的进程[15]。小动物主要用于研究疾病进展的病机和病理生理学特点，也用于对药物干预的首次筛查研究。小动物模型相对经济、快捷，缺点是与人类在解剖学、组织学和生理学等方面差异很大，在药物研究方面不能直接等效地推论到人类。例如，小鼠关节软骨的平均厚度是人类的1/70[16]。灵长类动物在生物学和行为学上与人类相似，其原发性KOA的发展和人类很相似[17]，而且创伤引起的应激障碍和抑郁症基本与人类一样[18]，但花费高。

2 KOA的西医病理学造模概述

KOA按病因分为原发性和继发性[15]，继发性包括创伤后、废用性和继发于其他系统性疾病的KOA，常以前两者进行动物模拟。对应经典的造模方式是人工诱導和自发造模，人工诱导包括关节制动、侵入性和非侵入性模型，侵入性模型主要是手术诱导和化学生物诱导，手术诱导包括关节内手术和关节外手术，关节内手术指破坏关节韧带、半月板、软骨、滑膜和植入异物等，关节外手术包括破坏关节周围肌肉、韧带、血管和切除卵巢等;非侵入性包括过关节撞击、关节内胫骨平台骨折、周期性胫骨平台软骨受压和胫骨过度负载等[19-20]。西医病理学造模方法繁多，还有一些创新的、少数人使用的造模方法未提及，每种具体的造模方式都有其优缺点，需要根据其特有的致病机制、病理变化特点以及自身需求选择合适的KOA模型。

3 KOA的中医证型造模

多数学者将KOA证型大致概括为正虚、邪实和虚实夹杂证。李具宝等[21]通过比较近10年文献中KOA患者内服方药，认为其对应的中医证型为虚证、实证和虚实夹杂证，虚证主要分为肝肾亏虚证、肾虚髓亏证、脾肾亏虚证等，实证主要有寒湿痹阻证、气滞血瘀证、湿热壅盛证、筋脉瘀滞证、风湿痹阻证等，虚实夹杂证包括阳虚寒凝证和气虚湿阻证。高玉花[22]通过检索与KOA证型相关的文献并对144例符合标准的女性患者进行回顾性研究，发现其基本证型是气血瘀滞证、肝肾不足证、脾肾阳虚证和寒湿痹阻证。胡彬等[23]采用KOA临床证候调查表，并运用对应分析和二步聚类分析得出3种主要证型，分别是肾虚髓亏型（50.5%）、阳虚寒凝型（3.5%）、瘀血阻滞型（23.0%）。何峰等[24]在对200例KOA患者辨证治疗研究中，将其进一步分为肝肾亏虚证、气滞血瘀证和寒湿痹阻证3种证型。因此，对应临床主要证型，目前动物实验也以肾阳虚、血瘀和寒湿模型为主。

3.1 肾阳虚模型 肾阳虚证模型是研究最早的中医证候动物模型，已有50多年历史，是连接西医基础和中医临床的枢纽，可深化对中医证候的认识，有利于中医药现代化发展[25]，简要概括当前动物造模方法，按照机制大致可分为西医病理学造模和中医病因学造模，且以前者多见。

3.1.1 西医病理学造模 沈自尹等[26-27]经过大量动物研究认为，下丘脑细胞损害及其引起的功能紊乱是肾阳虚证的主要病理基础，下丘脑受损导致下丘脑-垂体-肾上腺、甲状腺、性腺轴功能紊乱，继而其支配的代谢和免疫器官出现相应的功能失常或结构病理改变。进一步以药测证研究中采用基因芯片技术发现，肾虚证大鼠模型存在神经-内分泌-免疫和神经-内分泌-骨代谢两大基因调控路线紊乱[27]。西医病理学造模可分为肾上腺皮质、甲状腺和性腺功能抑制模型，DNA合成抑制肾阳虚模型和其他病理模型。

临床研究结果表明，肾阳虚证的表现与肾上腺皮质功能低下紧密相关[28]。肾上腺皮质功能抑制模型可分为糖皮质激素应用法，氨基导眠能灌胃法和肾上腺切除术。最早和最常用的是糖皮质激素法，大量文献表明，糖皮质激素药物种类繁多，造模时给药途径、剂量、给药时间、持续时间和动物选择等都有所差异，其中国内外最认可的方式是将氢化可的松注射液以10 mg·kg-1·d-1的剂量注射到成年大鼠腹腔，持续15 d即可成模[29]。其次是去势法。切除动物双侧睾丸或卵巢[30]，可成功模拟肾阳虚证。但也有研究认为，此法不仅创伤大且性腺轴的反馈途径中断，去势后的动物不能较好地模拟临床肾阳虚患者表现[31]。根据Hartley豚鼠关节软骨快速衰老的特性，笔者通过切除双侧卵巢成功构建绝经后原发性KOA模型[32]。最近，陈颖颖等[33]对SD大鼠采用Hulth造模法加不同浓度腺嘌呤灌胃成功构建肾虚型KOA模型，并发现100 mg·kg-1是最佳浓度。

3.1.2 中医病因学造模 肾藏精，主骨生髓，主人体发育和生殖。肾虚多由先天禀赋不足或后天失養，房劳内伤，久病耗气，年老或受惊所致。主要分为房事伤身、老年肾阳虚、恐伤肾和先天肾虚模型[34-36]。临床诊断肾虚的主要症状为异常精子质量，性功能低下，射精无力或性高潮失常[37]，而精液的代谢组学分析可用于区别肾虚不育男性的中医“证”型[38]。然而，笔者尚未发现运用中医病因学方法建立肾虚型KOA模型的文献报道。

目前，肾阳虚造模法种类繁多，病理造模方法远远多于病因造模，而后者被越来越多的研究者青睐。但两者都存在明显不足，前者只能反映临床肾虚病理的某一个方面，后者病因和病证之间不存在一一对应的关系[39]。病证结合模型将是未来发展的方向[40-42]。

3.2 血瘀模型 血瘀证的临床表现为舌质青紫、瘀斑等，动物实验的标准是舌质瘀紫、尾色瘀青、血流缓慢、血黏度增高等[43]，常用的造模方法是肾上腺皮质激素注射法[44]。具体方法是采用氢化可的松10 mg·kg-1·d-1肌肉注射，13次用药后肾上腺素0.36 mg·kg-1皮下注射1次。2013年，刘振峰等[45]用此法加经典Hulth造模法成功建立了动物体征和血液流变学均符合血瘀证的KOA大鼠模型;尽管临床上血瘀证常见，且常以活血法治之，但此后未见相关动物模型报道。

3.3 寒湿模型 《素问·痹论篇》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”风寒湿邪是重要的病因。2016年，李艳彦等[46]采用冷固法复制寒湿型KOA模型，通过将大鼠放入（6±0.5）℃的水中6 h，而后予以双下肢石膏固定18 h，如此反复5周后建模成功。随后，赵乐等[47]用此法成功建立寒湿证KOA动物模型，之后对此法改进，通过交替将大鼠双下肢伸直位石膏固定和自然站立于（6±2）℃冰水中各6 h，持续6周，也能成功构建该模型[48]。2020年，孙力威[49]采用石膏固定加低温环境刺激 加冰水站立成功建立寒湿证KOA模型。

4 KOA病证结合模型

辨病与辨证相结合已成为中医师主流的诊疗模式[50]，临床收效颇丰，虽然研究其作用机制的病证结合模型进展缓慢，却受越来越多学者的青睐。LIU等[51]关节内注射木瓜蛋白酶，并将膝关节在50 ℃环境下作用2 h，观察局部肿胀、疼痛和活动受限程度及软骨病理变化，得到肾虚血瘀型KOA模型。陈颖颖等[52]通过Hulth、Hulth及D半乳糖、Hulth及腺嘌呤、Hulth及去势法等不同造模方法对比发现，Hulth及去势法更适合建立大鼠KOA肾阳虚证模型;而笔者前期单纯采用去势法建立豚鼠绝经后原发性KOA肾阳虚证模型，可较好地模拟绝经后原发性KOA患者临床表现，操作虽然简单，但耗时太长[32]。为推动KOA模型更好地服务于科研，武晏屹等[53]以KOA中、西医最新临床诊疗规范为依据，创造性地提出了动物模型与中、西医的临床吻合度，也更有利于病证结合模型的发展。

5 小结与展望

KOA又名骨痹、痛痹、寒痹等。《张氏医通》曰：“骨痹者，即寒痹、痛痹也，其证痛苦攻心，四肢挛急，关节浮肿。”结合KOA中医病因证候文献，认为主要病因是肾虚、瘀血和寒湿，基本证型是肝肾亏虚、气滞血瘀和寒湿阻滞证，分别对应肾阳虚、血瘀和寒湿模型。中医学从整体辨证论治的角度出发，治疗KOA有独特的优势，而有关KOA的中医证候动物模型研究及相关文献资料缺乏或零散，尤其缺少病因学模型研究;加之临床上患者病证的复杂性和动态性，严重限制了中医药对KOA的深入研究。KOA证型大部分是多种病因相互作用的结果，进而出现多种证型兼夹或转变;因此，实际造模时可以将多种基本模型按需求和内在规律组合，建立符合中医临床的复合证候模型;但干预因素过多，实际操作困难，模型稳定性和可靠性不高。另外，动物的食水、垫料、光照及周围环境等饲养环境也极为重要。

KOA病因病机不明，是世界性难题，单纯用西医或中医都不能有效地解除患者病痛，中西医结合疗效显著。由此过渡到基础实验，将西方先进的KOA造模理念结合中医证候模型建立病证结合动物模型将是进一步认识KOA病因病机以及药物防治的主流方向[54]。当前KOA病证结合模型主要以西医病理病因造模为主，缺乏中医证候体现的病因或诱因，在西医建模基础上施加中医病因可能更有益。另外，科学地评价病证结合模型很难。宋亚刚等[55]提出“证候”评价指标加“病”评价指标综合评估，具体需要与兽医合作采集动物的“四诊信息”，结合基因组学、代谢组学和蛋白组学等信息，宏观微观相结合共同评价，必要时运用经典方剂佐证，这将是病证结合模型的发展方向。

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收稿日期：2021-03-20;修回日期：2021-04-15