雷公藤多苷片中雷公藤甲素与体外肝毒性相关性研究△

王曼虹，王雪，颜玉静，黄芝瑛，汪祺*，文海若*

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.中山大学 药学院，广东 广州 510006

雷公藤多苷片（TripterygiumGlycoside Tablets，TPT）由卫矛科雷公藤属植物雷公藤去皮制备而成，具有较强的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等药理作用[1]，对类风湿性关节炎、肾病综合征、自身免疫肝炎和皮肤病等均具有良好的治疗效果[2]。但自TPT应用于临床以来，其不良反应和器官毒性时有报道[3-4]，以肝脏毒性报道最为多见。如李红刚等[5]发现，683 例服用TPT 的病例中110 例出现肝损伤，发生率约为16%，具体临床表现为肝脏压痛感、皮肤和尿液黄染、血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶（AST）水平升高等。研究提示，其毒性作用机制可能与脂质过氧化、肝细胞过度凋亡、免疫损伤、肝药酶活性改变、糖和脂肪代谢异常等因素有关[6]。

TPT 所含成分复杂，主要成分包括生物碱、雷公藤甲素（triptolide，TP）、雷公藤内酯甲（wilforlide A，WA）和雷公藤红素等[7]。研究提示，TPT 中TP 活性最强，但因该成分同时具有较强的毒性作用[8-9]，《中华人民共和国药典》2020年版中TPT将TP列为检查项，规定其上限。前期采用国家药品监督管理局局颁标准（WS3-B-3350-98-2011）[10]对10个企业171批雷公藤多苷片进行标准检验发现，市场上TPT 中TP 含量多寡各异，部分企业生产的TPT中甚至不含有TP。因此，TPT的毒性是否仅与TP有关成为亟待解决的问题。

本研究采用人源肝细胞系HepaRG 研究不同生产企业生产的TPT 的肝毒性差异，同时明确TPT 中主要成分TP与肝毒性的相关性，本研究结果将为完善TPT的质量标准、临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器

VICTOR X5 型多功能酶标仪（PerkinElmer 公司）；BD FACSCalibur 型流式细胞仪（美国BD 公司）；H500FR 型台式高速冷冻离心机（Kokusan 公司）；7180 型全自动生化分析仪（日立公司）；PB203-N 型电子天平（Mettler-Toledo 公司）；CKX31 型显微镜（Olympus 公司）；SI-T246 Vortex-Ge 型涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；ND-2000 型分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司）；iBright 1500 型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；Quantstudio DX 型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司）。

1.2 试药

人源肝细胞系HepaRG 购自Thermo Fisher Scientific 公司，本研究所用细胞为第12～13 代。TP对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111567-201404，纯度：99.8%）；TPT（涉及生产企业：A～G，此处以字母代表；H 为在G 企业产品中人为在66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作为TP 毒性评价对照）；cell counting kit-8（cck-8，日本同仁化学研究所）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司）；TRNzol 总RNA 提取试剂（天根生化科技有限公司）；PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR® Premix ExTaq™Ⅱ(Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker（宝生物工程有限公司）；引物合成（北京Invitrogen公司）。

2 方法

2.1 细胞毒性考察

将处于对数生长期的HepaRG 细胞消化后，调整至5×104个/mL，在96 孔板中每孔接种约5000 个细胞，孵育18～24 h 后给药。分设空白对照组（不含HepaRG 细胞）、溶媒对照组［0.5%二甲基亚砜（DMSO）］及不同浓度的给药组［TP 及WA 浓度：5～320 nmol·L-1；TPT质量浓度：根据各TPT给药后细胞存活率，取半数抑制浓度（IC50）为中间浓度，并上下各设1 个浓度组］，于37 ℃、5% CO2的条件下孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 检测试剂10 μL，37 ℃避光孵育2 h 后用酶标仪检测各孔450 nm 波长处的吸光度值（A），按公式（1）计算细胞存活率。在进一步毒性研究中，不同受试物的给药浓度以IC50为中间浓度（高浓度时细胞存活率约为20%，低浓度时则约为70%）。

2.2 HepaRG细胞凋亡率考察

将处于对数生长期的HepaRG细胞消化后接种于6孔板中，待细胞贴壁生长覆盖皿底80%～90%时给药。分设溶媒对照组（0.5%DMSO）及不同浓度的给药组（详见2.1项），于37 ℃、5%CO2的条件下孵育24 h 后，收集上清液，并用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化细胞，合并收集于离心管中离心［4 ℃，3000 r·min-1，离心10 min（离心半径为13.5 cm）］。细胞经预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2 遍后，每管加1×binding buffer 100 μL 重悬细胞，在避光条件下每管加Annexin V-FITC 10 μL 并孵育15 min。之后，每管加碘化丙啶（PI）5 μL，孵育5 min。孵育完成后每管加入1×Binding Buffer 400 μL稀释，吹打混匀后转移至流式管中，1 h内上机检测。

2.3 HepaRG细胞生化指标测定

细胞培养和给药与2.2 项下方法相同。给药处理结束后，样本经离心［4 ℃，3000 r·min-1，离心10 min（离心半径为13.5 cm）］分离出上清液。使用全自动生化分析仪检测上清液中AST、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酰转肽酶（GGT）的水平。

2.4 HepaRG细胞因子水平测定

细胞培养、给药及消化收集与2.2 项下方法相同。用TRNzol 总RNA 提取试剂提取细胞样本的总RNA，以NanoDrop®ND-2000 测定总RNA 的浓度和纯度。使用含gDNA Eraser 的PrimeScript ™RT reagent Kit 进行cDNA 反转录后，经SYBR GreenⅠReal time PCR（内参为18S rRNA 基因），检测细胞样本中白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和γ-干扰素（IFN-γ）表达量的变化，引物序列设计见表1。

表1 实时定量PCR法细胞因子测定引物序列

2.5 统计学方法

细胞存活率、细胞凋亡率、生化指标水平、细胞因子水平等数据用（）表示。采用单因素方差分析对组间数据进行检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。数据图与统计结果经GraphPad Prism 7软件处理生成。

3 结果

前期采用国家药品监督管理局局颁标准（WS3-B-3350-98-2011）对10个企业171批雷公藤多苷片进行标准检验，在此基础上选取其中7家生产企业的TPT进行进一步研究。这7家生产企业TPT中，TP含量差异较大（表2～3）。以66.67 mg·mL-1TPT计，不同企业TPT中含有的TP质量浓度在0～77.78 μg·mL-1，其中企业G的产品中TP质量浓度为0 μg·mL-1[11]。

表2 不同生产企业TPT中TP含量（）μg/片

表2 不同生产企业TPT中TP含量（）μg/片

表3 不同生产企业每66.67 mg·mL-1 TPT中TP质量浓度（）

表3 不同生产企业每66.67 mg·mL-1 TPT中TP质量浓度（）

3.1 TP及TPT的细胞毒性

使用CCK-8 法测定HepaRG 细胞经不同浓度（5～320 nmol·L-1）TP 处理24 h 后的相对细胞存活率。结果发现，TP 的IC50约为15.14 nmol·L-1。以下研究重点考察不同生产企业TP含量与毒性差异之间的关联。

实验发现，所有企业的TPT 均可显著降低HepaRG 细胞的存活率，且随着TP 浓度增加，细胞存活率逐渐降低且存在浓度效应相关性，见图1。

图1 TP及不同企业TPT对HepaRG存活率的影响

H为G企业样品添加100 μg·mL-1TP的对照组，前者IC50低于后者（表4），提示TP 的加入可明显增加TPT制剂的细胞毒性。

表4 不同企业TPT对HepaRG细胞IC50 μg·mL-1

3.2 TP及TPT对HepaRG细胞凋亡率的影响

细胞凋亡是药源性肝损伤的重要作用机制之一，前期研究提示，诱导细胞凋亡是TP 的药效学及毒理作用机制之一[12]。本研究使用流式细胞计数法研究TP 对HepaRG 细胞凋亡率的影响，发现TP 浓度＞20 nmol·L-1（约为7.20 ng·mL-1）时可显著升高HepaRG 细胞凋亡率（P＜0.001），且呈一定浓度效应相关性（图2）。

图2 TP对HepaRG细胞凋亡率的影响（,n=3）

7 家生产企业TPT 的测定结果发现，除D 企业TPT中的低质量浓度6.66 μg·mL-1（相应TP质量浓度为7.20 ng·mL-1，与TP 单独给药导致凋亡起始浓度一致）仅引起HepaRG 细胞凋亡率微弱上升外（D毒性最弱，TP 含量也最低），其他企业TPT 均自低浓度起即可引起HepaRG 的凋亡率显著上升，且存在浓度效应相关性（P＜0.05，P＜0.001，图3）。结合不同TPT 中TP 浓度对HepaRG 细胞凋亡率的影响，TP 含量与HepaRG 细胞凋亡率有一定关联，其中H 为G 的TP 添加对照，添加TP 后凋亡率相比G略有升高。然而C 企业样品导致凋亡的起始浓度中含有的TP 经折算约为10 nmol·L-1，低于TP 单独给药导致凋亡的起始浓度。此外，在不含TP 的情况下，G仍可导致HepaRG细胞的凋亡率显著上升，提示TP并非TPT导致细胞凋亡的唯一决定因素。

图3 不同生产企业TPT（A～H）对HepaRG细胞凋亡率的影响

3.3 TP及TPT对HepaRG细胞生化指标的影响

血清生化指标中，AST、ALP、LDH、GGT 及CK 升高均与肝毒性有关[13]。研究结果发现（图4），TP 浓度＞20 nmol·L-1时可导致LDH 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），质量浓度＞40 nmol·L-1时可引起AST、ALP 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；TP 在40 nmol·L-1时还可引起CK 的显著升高（P＜0.05），在80 nmol·L-1时 可引起GGT 的显著升高（P＜0.01），提示TP在不同浓度可导致不同程度的肝细胞功能异常。

图4 TP对HepaRG生化指标的影响（,n=3）

不同企业样品的测定结果发现（图5），来自B、E、F 和H 企业的TPT 均可不同程度引起AST、ALP、LDH、CK、GGT等指标的升高，升高程度为H＞E＞B＞F；A 和C 企业的TPT 可引起AST、ALP、LDH、CK 的升高；G 企业的TPT 仅可引起AST、LDH 的升高，而D 企业TPT 对各个指标差异均无统计学意义（D 中TP 浓度最低）；结合各TPT 的药物浓度及TP 浓度，提示肝损伤的发生与TPT 中的TP浓度相关。实验为考察TP 的毒性作用，对比G 及人为添加TP 的对照H 样本，添加TP 可导致AST 和LDH进一步升高，提示TP是引起肝细胞损伤的重要因素；且TP 进一步升高ALP 及CK 水平[13]从而对胆汁淤积与细胞能量代谢产生影响，但除此以外，TPT 中其他成分也存在一定肝毒性风险。本研究结果提示，各企业的TPT 均有一定的肝损伤作用，且TP 含量与细胞毒性、细胞凋亡、ALP、CK、TNF-α和IFN-γ变化直接相关，AST、LDH、TNF-α和IFN-γ是检测TP导致的肝细胞毒性的较为灵敏指标，且变化趋势与文献中体内研究报道大致相符[14-16]。

图5 不同生产企业TPT对HepaRG细胞生化指标的影响（,n=3）

3.4 TP及TPT对HepaRG细胞因子水平的影响

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长及损伤组织修复等多种功能[13]。结果发现IL-6 和TNF-α为对TP 毒性最为灵敏的指标。TP浓度＞20 nmol·L-1时可显著降低IL-6和TNF-α的水平（P＜0.001），浓度为20～40 nmol·L-1时可显著升高IL-10及IFN-γ的水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，见图6）。TP 可影响多种细胞因子分泌水平，从而介导抗炎和免疫抑制作用，上述结果与文献报道基本相符[17-18]。

图6 TP对HepaRG细胞因子水平的影响（,n=3）

如图7 所示，来自7 个企业的TPT 均可降低HepaRG 细胞TNF-α的水平，且呈一定剂量效应相关性；此外，部分企业的TPT（如A、B、C、E 和F）可升高IL-10水平。上述变化趋势与TP的作用基本相符，提示TPT的抗炎与免疫抑制作用与TP含量有关。然而，部分企业的TPT（如A、B、D、G 和H）则诱导IL-6 的水平升高；部分企业的TPT（如A、B、C、E 和F）可显著降低IFN-γ水平，但B、E、F 和H 企业的TPT 作用浓度较高时（细胞存活率低于50%）导致IFN-γ水平升高，提示其虽有一定的抗炎作用，但也有一定的肝损伤作用。上述变化与TP 单独作用的结果不符，故推断TPT 中其他成分，尤其是在其存在一定细胞毒性的浓度下，可能对TP的抗炎作用产生一定影响。

图7 不同生产企业TPT对HepaRG细胞因子水平的影响（,n=3）

4 结论

TPT 是目前临床广泛使用的非甾体类免疫制剂[19]，其疗效显著，但临床不良反应不容忽视。据报道，TPT 的不良反应发生率可达58.1%，主要表现为药物性肝炎、肝功能异常等[20]。TPT 的不良反应极大地限制了其临床应用。研究提示，TPT 所含有的二萜、三萜类化合物及苷类物质均有一定的毒性[7]。现行标准将TP 列为检查项，控制其上限。然而，不同生产企业的TPT 中TP 质量浓度差异显著（0～77.78 μg·mL-1）[11]。尽管TP 药效显著，其毒性作用也不容忽视[21-22]。故将TP 含量控制在合理范围内是保障TPT 临床有效性、安全性的重要基础，本研究针对TP在TPT整体毒性中扮演的角色进行了有益的探索。

综上，本研究以HepaRG 细胞为实验模型，发现TP 含量与TPT 的肝细胞毒性存在正相关，当TP细胞给药浓度低于20 nmol·L-1时，其细胞毒性不明显，可作为其在药物中含量限设定的参考。然而TP的含量并非TPT诱发肝细胞毒性的唯一决定性因素。如A 企业和C 企业的TPT 也表现出较高的细胞毒性且AST等肝损伤指标呈显著性升高。然而两者TP含量较低，其肝毒性与TP含量无必然关联。因此，后续可针对TPT 中更多成分的肝损伤风险展开研究。本研究结果将为完善TPT 质量控制指标、临床合理应用提供参考。