牵牛子多糖PNP-5的结构表征及体外生物活性研究

孙延平,王博譞,刘艳,梁军,刘艳鑫,曹琦,杨炳友,王秋红,匡海学*

(1.黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国科学院大连化学物理研究所药用资源开发实验室，辽宁 大连 116023；3.哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150081;4.广东药科大学中药学院，广东 广州 512000)

牵牛子近年来研究文献较少，大多主要集中于对牵牛子药材本身的传统功用、临床应用、毒副作用及部分药理作用的总结归纳[1-5]，对于牵牛子的化学成分研究，近期仅限于对牵牛子苷类(树脂苷类)成分的结构研究[6]，以及牵牛子苷对抗癫痫、抗结肠癌、抗菌作用及机制研究[7-9]。目前对于牵牛子中大分子物质的研究，特别是多糖类成分研究较少，本课题组前期从中药药性理论的角度进行了牵牛子化学拆分组分的性味药理学评价及药味归属研究，发现PNP具有利尿、增加大鼠大肠推进率及化痰等药理作用[10]，此外，PNP通过降低炎性因子含量，提高肾小球过滤功能，显著改善大鼠肾病综合征,缓解水肿[11-12]。

多糖作为一种中药中广泛存在的大分子类化合物，具有复杂而多方面的生物活性和功能[13-17]，为了合理开发利用PNP这种丰富资源，多糖的结构表征及其潜在活性急需挖掘。因此，本研究从PNP中分离纯化得到均一多糖PNP-5，采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、高效凝胶排阻色谱(HPSEC)、高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)、高碘酸氧化Smith降解和甲基化分析、核磁共振(NMR)等技术从纯度、分子量、基团特征结构、单糖组成、主链侧链糖苷键连接方式和组成对PNP-5进行结构表征，并对其体外清除自由基活性及对体外小鼠脾细胞增殖活性进行了研究，以期为PNP的生物活性、作用机制和综合利用提供数据支持和理论依据。

1 仪器与材料

R-200旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；小型旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Alltech ELSD-2000蒸发光检测器(美国Alltech公司)；pH计Sartorius PB-20(德国Sartorius公司)；Shimadzu FTIR-8400S红外光谱仪(日本Shimadzu公司)；Shimadzu UV-1601紫外光谱仪(日本Shimadzu公司)；Thermo Fisher Scientific DSQ II气相色谱质谱仪(美国Thermo公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

弱阴性阴离子交换树脂FPA90Cl-(美国Amberlite公司)；弱阳性阳离子交换树脂IRC84(美国Amberlite公司)；离子交换纤维素DEAE Cellulose 52(英国Whatman公司)；离子交换琼脂糖凝胶DEAE-Sepharose F.F(瑞典Pharmacia公司)；丙烯葡聚糖凝胶Sephacyrl S-400(瑞典Pharmacia公司)；葡聚糖凝胶Sephadex G-50(瑞典Pharmacia公司)；糖柱Shodex sugar KS-805(日本Shodex公司)；标准葡聚糖Dextran(瑞典Pharmacia公司)；透析袋(截留分子量3500)(美国Sigma公司)；C.M.C[1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺对甲苯黄酸盐](美国Fluka公司)；硼氢化钠(美国Sigma公司)；三氟乙酸(德国Merck公司)；硫酸(北京市化学试剂公司)；氢氧化钠(天津市广成化学试剂有限公司)；重水D2O(瑞典Pharmacia公司)。

小鼠脾细胞来源BALB/c雄性小鼠，体质量18～22 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，并于SPF级动物实验室饲养。

牵牛子药材于2012年10月购自于哈尔滨市药材公司，产地为山东，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定，为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitisnil(L.)Choisy的干燥成熟种子，标本保存于黑龙江中医药大学药学院中药化学实验室。

2 方法

2.1 PNP-5的提取分离制备

将1 kg干燥的牵牛子用95%乙醇加热回流提取，过滤，药渣用水煎煮冷却后滤过、合并滤液。加入95%乙醇使乙醇终浓度为85%，收集沉淀，冷冻干燥，得182 g牵牛子粗多糖。20 g 牵牛子粗多糖加入蒸馏水，使溶解成终浓度为5%的溶液，经过Amberlite FPA90-Cl-(5 cm×50 cm)+Amberlite IRC-84(5 cm×50 cm)阴阳离子串联树脂柱，得到水洗脱部位，再经DEAE-Cellulose DE-52(3.5 cm×50 cm)0.4 mol/L NaCl水溶液洗脱和Sephacryl S-400(1.6 cm×75 cm)凝胶色谱柱水洗脱，进一步分离纯化，得到282 mg牵牛子均一多糖，并命名为PNP-5(Pharbitis nil polysaccharide-5)。

2.2 PNP-5结构表征

2.2.1 UV光谱测试

将PNP-5以蒸馏水配成浓度为2.0 mg/mL的溶液，离心，取上清液在190～400 nm内利用紫外分光光度计进行扫描，以确定牵牛子多糖中是否含有核酸和蛋白质缀合物。

2.2.2 纯度检验及相对分子质量测定

采用Waters高效液相色谱系统(2996泵，Alltech ELSD2000，Shodex sugar KS-805+保护柱KS-G)进行HPSEC法测试，室温下以超纯水为流动相，流速为0.5 mL/min。标准葡聚糖Dextran T10、Dextran T40、Dextran T70、Dextran T500、Dextran T2000作为标准品配置溶液进样，以分子量的lg值为横坐标，以保留时间tR为纵坐标作标准曲线，求得标准曲线的回归方程。PNP-5样品同法制备，进样。根据保留时间，根据标准曲线回归方程计算PNP-5分子量。

2.2.3 IR光谱测试

取2 mg PNP-5多糖样品，用KBr压片后进行常规IR扫描，扫描波长400～4 000 cm-1；对甲基化多糖样品，则采用氯仿液膜的形式进行IR光谱扫描。

2.2.4 单糖组成的测定

称取10 mg PNP-5样品用2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液110 ℃水解8 h，经离心分离取上清液，用甲醇反复减压回收除去TFA至pH值为7.0，用去离子水定容至2.0 mL，离心，取上清液进行PMP衍生化，经HPLC分析，在与以上相同条件下，以8种单糖：甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)作为对照品溶液制作峰面积与浓度的标准曲线回归方程，根据各单糖对照品的保留时间，确定牵牛子多糖的单糖组成。

具体色谱条件采用Diamonsil®C18(2)色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)。流动相A：0.05 mol/L磷酸盐(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)缓冲液-乙腈(体积比为85∶15)；流动相B：0.05 mol/L磷酸盐(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)缓冲液-乙腈(体积比为60∶40)。梯度洗脱条件：时间为0→10→30 min，对应流动相为100%→92%→80%溶剂A。紫外检测波长为250 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为10 μL。

2.2.5 高碘酸氧化Smith降解

依据文献[18]方法进行高碘酸氧化反应，最终计算出高碘酸的消耗量和甲酸的生成量。然后进行Smith降解反应，将乙二醇处理后的溶液透析，取透析袋内液浓缩，加入NaBH4还原过夜。用50%HAc中和至pH为6～7，蒸馏水透析。取1/3干燥后做GC分析，剩余部分进行Smith降解。加入等体积的1 mol/L H2SO4，25 ℃水解40 h，BaCO3中和至pH为6，用定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析，袋外部分干燥做GC分析，袋内加乙醇醇析，离心，上清及沉淀部分干燥后分别做GC分析。

2.2.6 甲基化分析

参考文献方法[19-20]，取20 mg PNP-5进行甲基化，经氯仿反复萃取后，IR图谱在3 400 cm-1处无吸收峰，即无羟基吸收峰，则证明多糖甲基化完全。再经水解、还原、乙酰化，进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：采用Agilent 5975C气质联用仪，配备DB-1701毛细管柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm，程序升温，柱温80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min至200 ℃，以2 ℃/min至220 ℃，以10 ℃/min至270 ℃，保持1 min，氦气作载气，进样口温度250 ℃，分流比1∶42，柱流速1.2 mL/min。EI(70 eV)，接口温度250 ℃，离子源温度250 ℃，扫描范围：m/z43～500，扫描速率：2.5 scan/s。

2.2.7 磁共振光谱分析

取PNP-5样品40～60 mg溶于1 mL D2O，冻干后再次溶解于2 mL D2O，离心，上清液装入核磁管，于室温核磁共振仪上进行13C-NMR光谱测定。

2.3 体外生物活性研究

2.3.1 PNP-5体外清除ABTS+·活性测定

体外抗氧化活性采用简单方便快速的体外抗ABTS+·自由基实验，测定步骤如下：首先将ABTS溶于0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)溶液中，配成浓度为7 mol/L的溶液。然后，将7 mol/L的ABTS溶液加入过硫酸钾使之终浓度为2.45 mol/L，即可配制成ABTS+·,混合溶液黑暗中静置16 h开始使用。ABTS+·溶液用PBS溶液稀释至吸光度为0.70±0.02(734 nm)，水浴30℃平衡30 min。把PNP-5样品稀释成浓度为0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.5和5 mg/mL，各0.2 mL，加入2.0 mL稀释好的ABTS+·溶液。在室温下反应20 min后，在波长为734 nm下，迅速测定并记录吸光度。维生素C(Vc)作为标准对照品。ABTS自由基清除率百分比计算，根据公式如下：ABTS清除率(%)=[A0-(As-Ab)]/A0×100。其中A0为ABTS未加入样品的A734；As为ABTS加入样品的A734；Ab为样品未加入ABTS的A734。

2.3.2 PNP-5体外对小鼠脾细胞增殖活性的影响

准确称取PNP-5样品1～2 mg，溶于适量生理盐水，浓度为4 mg/mL。使用前分别取适量上述多糖溶液稀释至浓度为5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。小鼠颈椎脱位处死，眼球放血，75%酒精消毒。无菌取脾，置于盛无菌PBS液的培养皿中，用注射器片芯研磨后过100目筛网，用PBS冲洗3次。用PBS液洗涤小鼠脾细胞2次，每次用量10 mL左右。后1 000 r/min离心10 min，弃上清。加10 mL 10% FCS-RPMI-1640培养液，混匀，用血球计数板计数细胞，后调细胞浓度至1×108/mL。将PNP-5各个浓度100 μL/孔，均设6个复孔，100 μL/孔，加入96孔培养板中，以RPMI-1640对照。每孔加细胞悬液100 μL，置5%CO2培养箱中37 ℃培养44 h。每孔加入5 mg/mL MTT 10μL，继续培养4 h，再加入二甲亚砜100 μL，于微量振荡器上缓慢作用10 min，在酶标仪上于492 nm处测吸光度值。

2.4 统计学处理

3 结果与讨论

3.1 UV光谱分析

PNP-5冻干品为土黄色絮状物，吸湿性强，能溶于水，易溶于热水，不溶于有机溶剂。PNP-5的紫外光谱在260 nm和280 nm处无明显吸收峰，表明无核酸和蛋白质(图1)。

图1 PNP-5 UV光谱图

3.2 纯度检验及相对分子质量测定

按tR-lgM关系作图得到标准葡聚糖的分子量标准曲线，标准曲线的回归方程为y=0.445 5x+14.146,R2=0.993 6。HPSEC法测定PNP-5凝胶曲线图谱见图2，显示为单一对称峰，表明PNP-5为均一性多糖。根据PNP-5的保留时间tR为17.721 min，计算出它们的分子量为1.78×106Da。

3.3 IR光谱分析

PNP-5的IR光谱显示其具有多糖类物质的特征吸收峰(图3)，3 355 cm-1出现一种宽峰，为O-H的伸缩振动峰，表明多糖存在分子内和分子间的氢键；2 931 cm-1处有吸收，为C-H的伸缩振动峰；1 647 cm-1处为糖类-OH吸收峰；1 600 cm-1、1 417 cm-1有吸收表明有羧酸离子存在；在1 400～1 410 cm-1处有吸收峰，可能为C-O伸缩振动引起的；在1 240～1 040 cm-1间有特征峰，可能为O-H变角振动引起的，1 147 cm-1、1 060 cm-1、1 041 cm-1处具有很强的糖环特征吸收，表明具有吡喃环特征结构。

3.4 单糖组成分析

将PNP-5完全酸水解后，通过PMP柱前衍生，经高效液相定量分析，见图4，结果表明PNP-5的组成单糖为Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal和Ara，其摩尔比为3.2∶10.6∶5.7∶1.5∶1.0∶4.5∶1.7∶4.5，相应的摩尔百分数分别为9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%和13.7%。以上数据表明，PNP-5为一个以鼠李糖为主的酸性杂多糖。

图2 PNP-5的HPSEC色谱图 (tR=17.721 min)

图3 PNP-5的IR光谱图

图4 PNP-5经完全酸水解后的PMP衍生物HPLC图

3.5 高碘酸氧化Smith降解反应分析

将PNP-5进行高碘酸氧化反应，结果表明生成甲酸的键型占30.5%，说明每10个己糖残基大约有3个非还原末端或1→6糖苷键，并且存在连三羟基，即存在1→或1→6键型；被高碘酸氧化但不产生甲酸的键型占52.1%，说明有约1/2的键型为1→2、1→2,6、1→4或1→4,6等键型；不被高碘酸氧化的键型占17.4%，说明还有少量的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4键型中的某些键型。

高碘酸氧化后进行完全酸水解，只检出大量的Gly、Ery、Rha，此外还有少量的Gal，表明糖链中主要存在1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6等键型中的某些键型，且Rha及Gal中含有某些不被高碘酸氧化的键型如1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4等键型。经Smith降解后，袋内沉淀检出Gly、Ery、Rha和Gal，表明主链核心部分含有1→、1→6、1→2、1→2,6、1→4、1→4,6中的某些键型，且Rha和Gal所含的1→3，或1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→3,6、1→2,3,4键型中的某些键型存在于主链核心部分；袋内上清部分只检测出含有Ery，说明支链或主链边缘只存在1→4或1→4,6键型；袋外部分只检测出含有Gly，说明支链或者主链的末端残基上含有1→、1→6、1→2、1→2,6中的某些键型(表1)。

表1 PNP-5经高碘酸氧化Smith降解片段结果

3.6 甲基化分析

将PNP-5的甲基化产物，通过酸水解、乙酰化制备成其阿尔迪醇乙酸酯，经过GC-MS分析，可以得到PNP-5中糖残基的各种连接方式(表2)。其中阿拉伯糖基只表现出1种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,5-tri-O-methyl-1,4-di-O-acetyl-arabinitol，表明阿拉伯糖以呋喃环的形式存在，其连接方式主要为T-Araf-(1→，约占13.7%；鼠李糖共表现出2种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即3,4,6-tri-O-methyl-1,2,5-tri-O-acetyl-rhamnitol、3,6-di-O-methyl-1,2,4,5-tetra-O-acetyl-rhamnitol，表明鼠李糖均以吡喃环的形式存在，其连接方式为→2)-Rhap-(1→和→2,4)-Rhap-(1→，其中以→2)-Rhap-(1→为主，约占20.2%；甘露糖只表现出1种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即2,3-di-O-methyl-1,4,5,6-tetra-O-acetyl-mannitol，表明甘露糖以吡喃环的形式存在，其连接方式为→4,6)-Manp-(1→，约占9.9%；木糖只表现出1种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4,6-tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-xylitol，表明木糖以吡喃环的形式存在，其连接方式为T-Xylp-(1→，约占13.7%；葡萄糖只表现出1种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即2,3,4-tri-O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-glucitol，表明葡萄糖以吡喃环的形式存在，其连接方式主要为→6)-Glcp-(1→，约占3.1%；半乳糖只表现出1种阿尔迪醇乙酸酯衍生物，即2,4-di-O-methyl-1,3,5,6-tetra-O-acetyl-galactitol，表明半乳糖以吡喃环的形式存在，其连接方式主要为→3,6)-Galp-(1→，约占5.3%；糖醛酸主要表现为→4)-GalpA-(1→和→4)-GlcpA-(1→，其分别约占4.6%和17.4%。我们发现经过1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺对甲苯黄酸盐(CMC)还原后的CMC-PNP-5色谱图较还原前的PNP-5多检测出2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylgalactitol和2,3,6-tri-O-methyl-1,4,5-tri-O-acetylglucitol，因此确定了PNP-5中糖醛酸的连接方式。

表2 PNP-5的糖连接方式分析

3.7 核磁谱分析

PNP-5的13C-NMR谱(图5)中，在δ54.6处的碳信号，可归属于糖醛酸甲酯化后的甲氧基碳信号。δ16.5～17.8处的碳信号，为鼠李糖碳6上的碳信号。δ20～24范围内出现的甲基信号证明存在氨基糖。在糖残基端基碳信号区，δ103.7处的碳信号，可归属于α-D-Araf、(1→2,4)-α-Rhap、(1→4,6)-β-D-Manp、β-D-Xylp、(1→4)-α-GlcpA端基碳信号；δ97.9处的宽单峰碳信号，可归属于(1→2)-α-Rhap端基碳信号。

图5 PNP-5的13C-NMR谱

3.8 PNP-5体外清除ABTS+·活性

表3为Vc、PNP-5对ABTS自由基的清除率数据。从数据可以看出，PNP-5具有明显的量效关系，呈现出剂量依赖性，并具有良好的自由基清除能力。在浓度为0.078125 mg/mL时，Vc、PNP-5样品ABTS自由基清除率差别不显著。在浓度为1.25 mg/mL时，清除率就可达到98.46%，PNP-5样品在1.25～ 5mg/mL浓度时，ABTS自由基清除率均接近100%，并具有明显的量效关系。通过计算IC50为0.339接近Vc的0.111，表明PNP-5对ABTS自由基的清除能力很强。

表3 PNP-5对ABTS自由基清除活性

3.9 PNP-5体外对小鼠脾细胞增殖活性的影响

由表4可知，PNP-5在5～125 μg/mL浓度范围内均对小鼠脾淋巴细胞增殖产生抑制作用，并且随着剂量的增加，增殖指数逐渐降低。随着剂量的增加，增殖指数逐渐降低，当PNP-5浓度达到125 μg/mL时，小鼠脾细胞增殖指数为0.70±0.05，与空白组比较，具有极显著差异(P<0.01)，此时对小鼠脾淋巴细胞增殖产生非常显著的抑制作用。

表4 不同浓度PNP-5体外对小鼠脾细胞增殖指数影响

4 结论

综合IR光谱、糖组成分析、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及13C-NMR光谱等化学和波谱学方法，对PNP-5的结构表征如下：PNP-5的单糖组成为Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Xyl、Gal、Ara，其摩尔百分数分别为9.9%、32.3%、17.4%、4.6%、3.1%、13.7%、5.3%、13.7%。可知PNP-5亦为一个以Rha为主的酸性杂多糖。其苷键构型同时包含α和β两种。PNP-5主链可能以Rha为核心连接少量的Glc、Gal和Man作为主链，支链部分主要包含GlcA、GalA。其中，这些醛酸是在Rha的C-4位有连接的分支点，在Gal的C-6位有连接的分支点，此外还在Man的C-6位有连接的分支点。PNP-5的末端残基为α-Araf-(1→和β-D-Xylp-(1→。体外生物活性研究结果显示，ABTS自由基清除率IC50值为0.339mg/mL，表明PNP-5具有很强的ABTS自由基清除能力。此外，PNP-5在5～125 μg/mL浓度时，具有明显的体外抑制小鼠脾细胞增殖活性，且随着剂量的增加，其抑制作用逐渐加强。