新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

张婉琪，赵玉宾，丁繁萍，王青青，王哲红，胡建军*

（1塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2哈密市动物疫病预防控制中心，新疆 哈密 839000）

（3塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（4哈密市信访局，新疆 哈密 839000）

乳头瘤病毒(papillomaviruses，PV)是一种常见的传染性病原体，广泛存在于自然界[1]能感染人[2-3]和大多数动物[4-5]。其中，牛乳头状瘤病(Bovine papillomatosis，BP)是由牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirous，BPV)引起的一种引发良性或恶性上皮细胞增生的肿瘤性疾病，也称为疣[6]，主要表现为皮肤、黏膜形成纤维乳头状瘤[7-8]。该病呈世界流行，患畜感染病毒后或因继发感染造成生产性能的下降，严重的恶性肿瘤病变可导致患畜死亡，牛乳头状瘤的传播给养殖业带来严重的经济损失[9]。

目前，已知的BPV基因型至少有24种，另外尚有未分型的假定基因型[10-11]。BPV的基因组主要由早期转录区、晚期转录区和长控区3部分组成，其中L1基因位于晚期转录区具有一定的免疫原性，可作为基因工程疫苗的候选基因。本研究在前期已完成对新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型全长分析及L1基因克隆基础上，以牛乳头瘤病毒1型L1基因为目的基因，设计一对特异引物扩增该基因片段，将获得的目的基因序列构建在pET32a表达载体中，在宿主菌BL21中进行体外诱导表达，以期获得L1蛋白为后续基因工程疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

牛乳头状体表赘生物样品来源于新疆南疆某牛场。大肠埃希菌DH5α、BL21（DE3）、原核表达载体pET-32a，均由本实验室自行构建保存。2×Taq pfu PCR Mastermix，pGM-T载体连接试剂盒，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒小提取试剂盒，低分子量蛋白MARK均购自天根生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ，XholⅠ购自大连宝生物（TATARA）公司；E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit、E.Z.N.A.Tissue DNA Kit购自美国OMEGA公司；蛋白MARK购自Thermo生物科技公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自北京索来宝生物技术有限公司；醋酸纤维膜、Western blot试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；Anti-HPV antibody[BPV-1/1H8+CAMVIR]单克隆抗体购自Abcom公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京中彬金桥生物技术有限公司；显影定影试剂盒，超敏ECL化学发光即用型底物购自博士德生物工程有限公司；其余耗材试剂为国产或进口的分析纯试剂。

1.2 引物的设计与合成

依据GenBank中已发表的牛乳头瘤病毒1型全基因组编码序列（KX907623.1）中的L1基因，利用Primer 5.0软件设计1对上游下游分别含有EcoRⅠ和XholⅠ限制性内切酶位点的引物如下。上游引物：5’-ATGAATTCATGGCGTTGTGG-3’（下划线为酶切位点）；下游引物：5’-CCGCTCGAGGTGCAGTTGACTTACCTTCTG-3’（下划线为酶切位点）。引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 牛乳头瘤病毒1型L1基因的扩增与回收

-20℃冻存DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：模板DNA 5.0 μL，ddH2O 18.0 μL，2×Tap pfu PCR Master Mix 2.0 μL，引物 Primer F 1.0 μL，引物Primer R 1.0 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s；58℃退火45 s；72℃每kb延伸1 min30 s；35个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增片段大小。

1.4 牛乳头瘤病毒1型L1基因的克隆与表达

纯化回收的L1基因和pET-32a进行转化连接，并在大肠杆菌细胞中表达。以不同浓度的IPTG(0.4～ 1.0 mmol/L)和不同时间间隔(1 h、2 h、3 h、4 h、5h、6 h)诱导表达目的蛋白，检测其最佳表达水平，采用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。重组蛋白经His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)纯化，SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。

2 结果

2.1 L1基因的PCR扩增与重组载体的构建

以牛乳头瘤病毒1型为模版基因组，设计L1基因特异性引物，产物经琼脂糖凝胶，结果表明，PCR产物扩增大小为1488 bp，与预期目的片段大小相符，未见非特异性扩增条带（图1）。用限制性内切酶EcoRⅠ和XholⅠ分别双酶切胶回收目的片段和pET-32a质粒，分别纯化回收目的基因L1小片段和载体pET-32a大片段，连接转化，菌液PCR扩增，将鉴定为阳性克隆的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，获得约5.4 kb和1.5 kb两条带，大小与载体片段和目的片段长度相符（图2）。测序结果进一步证实原核表达载体构建成功。

图1 BPV1L1 PCR产物电泳结果

图2 重组质粒pET-32a-BPV-L1的PCR和酶切鉴定

2.2 基因序列分析

经测序后，获得L1基因全长序列，序列长度为1488 bp，与BPV-1参考株（X02346和NC001522）核苷酸同源性均达到99.70%，氨基酸同源性均达到99.20%；与BPV-2型参考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性均达到了84.50%，氨基酸同源性分别为 92.50%、92.10%；与 BPV-13型参考株（JQ798171）的核苷酸同源性达到了85.70%；氨基酸同源性为92.70%。L1基因与BPV-1参考株（X02346和NC001522）相比，5处发生突变：A135G、C1043A、C1052A、G1192C、C1251G，其中同义突变两处，错义突变3处，348位氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸即Thr→Asn，351为氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸即Thr→Lys，398位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺即Glu→Gln。

2.3 L1蛋白一级结构

参照ExPASy Tools软件将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果如表1。

表1 L1蛋白一级结构

2.4 L1蛋白二级结构

参照ExPASy Tools软件中的SOSUI分析工具，将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，比对结果显示，L1二级结构中无规则卷曲所有结构中占39.80%，见表2。

表2 L1蛋白二级结构

2.5 L1蛋白三级结构预测

参照ExPASy Tools软件中的SWISS-MODEL和Phyre分析工具，将L1基因核苷酸序列转为氨基酸序列，在线分析蛋白三级结构可见，预测的蛋白三级结构表明多呈现无规则卷曲的分布，如图3。

图3 L1蛋白三级结构预测

2.6 牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达与检测

提取IPTG诱导后的BL21大肠杆菌中的蛋白，经12%分离胶进行SDS-PAGE电泳分析得到大小约在75 kD处有目的条带，而空的表达载体pET-32a在该位置处没有条带(图4)，结果与预期结果相同，说明L1蛋白可以在外源细胞（BL21）中表达。

2.7 重组蛋白诱导条件的优化

经测序正确的重组质粒转入BL21后，在不同IPTG诱导浓度下，当IPTG终浓度为0.8 mmol/L时可以从蛋白电泳图中明显看出重组蛋白表达；当改变诱导时间时，诱导时间为4 h时，从蛋白电泳条带可明显看出重组蛋白表达；结果如图5所示。

图5 重组蛋白诱导条件优化电泳图

2.8 重组蛋白可溶性分析及纯化蛋白Western blot检测

按照优化后条件诱导表达重组蛋白，超声破碎后分别收集沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明蛋白主要在沉淀中（包涵体）表达（图6）。收集纯化后蛋白，转膜后经1:1500稀释的商品化的一抗Anti-HPV antibody[BPV-1/1H8+CAMVIR]孵育，再经1:2000稀释的特定的HRP标记的羊抗鼠二抗即辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育。用手术剪剪取75 kD处PVDF膜，经过X胶片的显影定影后，可见明显条带（图6），表明目的蛋白表达成功。

图6 重组蛋白可溶性分析及Western blot检测

3 讨论

乳头瘤病是自然界中一种较为常见的肿瘤性疾病，可以感染多种宿主。大多数的牛乳头瘤病毒感染患畜可以自行痊愈，但严重的恶性肿瘤是无法治愈的，甚至可引起患畜死亡，造成养牛业严重的经济损失。新疆本地也有发生，贺志昊[14]对新疆北疆地区牛乳头瘤病毒感染进行了流行病学研究，并对主要流行株进行了基因分型和蛋白表达研究。王青青等[15]、张婉琪等[16-18]对新疆南疆地区的牛乳头状瘤感染进行了鉴定与分型工作。目前，国内外还没有合适的疫苗用于BPV的预防，因此疫苗的研究具有实践意义。

BPV为DNA病毒，闭合环状双链结构，无囊膜、核衣壳呈二十面立体对称。全基因组序列长约7.3～8.0 kbp，含有牛乳头瘤病毒基因组所具有的结构特征。在晚期表达的基因组中包含L1和L2，在BPV基因组中，作为最保守的片段常被用来鉴定新的基因型。LOVE A J等[19]研究首次报道了在本氏烟草内成功表达并分离了完整的BPV-1L1类病毒颗粒(VLPs)，且证明了这些病毒颗粒可引起高强度的特异性免疫反应，为潜在疫苗的制备提供了一个新的方向。

目前，解析蛋白质结构的常见实验方法主要为核磁共振、X射线晶体学和冷冻电镜等，实验成本相对较高。特别是对于体外表达存在困难的大分子量的单一蛋白来说，获得高质量样品用于结构解析是具有挑战性的，蛋白结构预测为蛋白质结构和功能的研究提供了可能。

本试验通过对BPV-1 L1蛋白一级结构预测分析可知，蛋白不稳定系数为39.42，平均疏水性-0.466，表明该蛋白是具有亲水性且分子结构稳定；蛋白二级结构预测分析可知，无规则卷曲结构占比高，达到39.80%，L1蛋白的二级结构以无规则卷曲结构为主要优势；同时，在蛋白的三级结构预测中，BPV-1 L1蛋白的无规则卷曲结构多位于分子表面，而无规卷曲占据较多，容易形成抗原表位，而L1蛋白这种三级结构保守性所对应的多种抗原表位对刺激机体产生保护性抗体十分有利，有助于筛选相应的抗原决定簇和靶向目标分子，可进一步利用其研发疫苗。

L1基因编码的蛋白具有较高的保守性，是病毒的主要衣壳蛋白，同时也是常见的用于研究乳头瘤病毒基因疫苗的备选基因。本研究中Western blot试验也证实了经蛋白结构预测获得的纯化L1蛋白能与牛乳头瘤病毒1型特异性抗体发生结合反应，具有良好的反应原性，验证了本研究中的L1蛋白结构预测为有效的，这为研制疫苗奠定了基础。

4 结论

本试验成功构建BPV-1-L1原核表达体系并表达目的蛋白，为后续L1基因相关疫苗与诊断试剂的研究奠定了基础。