血液制品病毒安全性控制措施研究进展

黄进英

【摘要】文章主要是分析了血液制品染菌的危害，在此基础上讲解了细菌污染途径及控制措施，最后探讨了几种有效能够灭活病毒的方法，望可以为有关人员提供到一定的参考和帮助。

【关键词】血液制品;病毒灭活;原理;安全性

【中图分类号】R392-33   【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.210

前言

血液制品主要是从一些健康的血液中通过分离、纯化或由DNA重组技术所创新制备出来的白蛋白类、球蛋白类以及凝血因子类等，这些血液制品可以有效的在急救、疾病预防所需要用到的药物上，血液制品的安全是人们共同关注的重要问题，为此如何有效的去除其中的病毒是科学人员应当不断进行探索和解决的难点。

1  血液制品染菌的危害

血液制品污染引起的菌血症最初是通过输血并发症来的。虽然菌血症的发病率不高，但会导致严重的后果。据报道，1986年至1989年，美国共有7例患者因输注细菌污染的血小板而死亡，尽管大多数液体血液制品在污染后可能出现明显的生物膜、霉菌团和丝状物，或液体浑浊、产生颗粒和气体，这些都可以通过清晰度检测出来，但对于那些单瓶冻干血液制品在分装或冻干过程中，细菌感染后不易被检出，对患者造成了一定的威胁。

2  细菌污染途径及控制措施

细菌污染可能发生在整个血液制品的生产过程中。潜在的有害细菌通常来自原料或个人接触受污染的产品。由于细菌污染途径的多样性，通常很难控制被污染的细菌。因此，为可以制备安全可靠的血液制品，至少应从原血浆、原材料和包装过程的质量控制方面采取到了有效的控制措施。

2.1原料血浆污染

在血液收集和血浆分离过程中消毒效果不佳，血液收集前的消毒效果不佳，血液收集器和血浆容器的不完全消毒将直接影响原始血浆的质量。结果表明，主要污染细菌是G B细菌。在血液收集和血液捐赠的消毒作用和血浆中的污染细菌中检测到细菌之间存在一定的关系。孤立的细菌主要是G B细菌。因此，在血液收集前严格的消毒和无菌操作是确保血浆无菌性的重要前提。按照世界卫生组织（1995年版）的规定，应以一种方式对血液供血的静脉刺穿部位的皮肤，以确保血液收集是没有细菌的。当血液按照无菌程序收集到容器中时，原料血浆的最大细菌计数应在投料前控制50cfu/ml。涂层分离应在无菌封闭的塑料袋系统中进行。防止分离血浆再次被细菌污染，应该在6小时内冷冻并储存-25℃。

2.2原辅料的污染

因为多种原料和辅助材料如糖，酒精或一些化学试剂，辅料、包括生产水、可能导致由于微生物污染，原料和辅助材料如氨基酸和使用的含有副产品的细菌污染在静脉内免疫球蛋白的制备中应计数细菌，并且在使用前应该消毒并过滤灭菌原料和过滤，并且应该进行消毒和过滤，每次进行常规细菌计数制定了原料和辅助材料，以及相应的许可和排斥限制标准。

2.3分装过程的污染

为可以保证灭菌系统的安全性和无菌包装质量的可靠性，在灭菌和过滤前应对滤膜的泡点进行检测。无菌室的清洁是保证产品无菌质量的重要环节。FDA指出，保证产品质量的关键是在极高的环境质量条件下对产品进行包装和密封。无菌室中的微生物含量不应超过25 CFU/10立方英尺是可以接受的。我国药品生产管理标准中无菌室的无菌等级是万级≤1cfu/平均。工人的频繁活动导致灰尘附着的细菌污染产品。按照人们在无菌室中的人们的活动的粒子状态，从静态状态产生到快速移动状态的颗粒可以产生100000/min-3千万/min。因此，分配人员应加强无菌概念和无菌手术技术，定期在分配人员手指上进行细菌文化，并为分配人员和血液产品建立一个系统。在储存或运输过程中，由于挤压，容器损坏，因此，选择高质量的储存容器非常重要。

3  经血传播的病原体

理论上，如果病毒感染时出现病毒血症，则可能通过输血和血液制品传播。经确认的血源病毒包括HIV、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒和G型肝炎病毒、输血传播病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人T淋巴细胞白血病病毒、EB病毒、人类疱疹病毒-8、人细小病毒B19、西尼罗河病毒等。在采取有效的原始血浆筛查和病毒灭活/清除措施前，报告了HIV、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV、TTV、B19等血液制品。突变病原体是一种只含一种蛋白质而不含核酸的病原体，目前还没有证据表明它可以通过血液制品传播，但近年来，又有一起疑似输血感染凝血因子Ⅷ的病例报道。世界各国已经进行了更为准确的风险评估，尚不能排除这些风险。在生产血液产品的过程中，可以通过无菌过滤除去细菌，寄生虫和其他病原体，这不会对血液产品的安全构成威胁。

4  献浆员的遴选与病原体检测

原料血浆的质量是保证血液制品安全的首要条件。经过几十年的发展，世界各国已经形成了一套严格的血浆采集和供应体系。以美国为例，FDA从1973年开始对血浆采集和供应机构进行监督管理，通过质量保证、血浆捐献者资格认证、临床试验认证、实验室认证、药物警戒等五大质量体系，建立了一套完整的管理体系和监测体系，血浆采集/处理、检疫/储存/处置系统包括血浆供体筛查、检疫隔离、血浆检测等五个安全环节，事故监测和调查有效保障了血浆采集的安全和原料血浆的质量。目前，血液产品仅由中国等离子交换收集的固定健康人血浆产生。从理论上讲，风险很小。中国有超过100个血浆分离站，由各种血液制品企业进行操作和管理，并严格受到国家的监督。其管理系统和质量标准基本达到了欧洲和美国发达国家的水平。首先，有必要严格选择血浆捐赠者，包括健康状况，体检和验血。只有令人满意的结果只能提供血浆。在血浆收集后，一系列病毒试验应在单血浆上进行，并预先生产的混合血浆，以确保没有病毒污染。各国都出台了相关规定或指导方针，并严格对原浆病毒检测、血浆筛查方法、仅进行血清学检测，由于检测灵敏度等局限性，病毒抗体在阳转血浆样本内潜伏期（窗口期）会产生不可避免的误解，导致部分血液制品（如脆性凝血因子VIII）传播血源病毒，因此自上世纪90年代以来，发达国家在加强病毒灭活/去除过程的同时，提高了核酸扩增检测技术，提高了血液制品的检测水平。在我国的药典中，血液产品的血浆血浆应通过氨胺转移酶，乙型肝炎表面抗原，HIV1/2抗体，HCV抗体检测，NAT测试，欧洲药物管理，单次失败需要HBsAg，HIV1/2ARIBODIES，HCV抗体，HCSAG，HIV1/2抗体，HCVRNA，此外，病毒灭活的混合血浆增加了B19DNA和HAVRNA两种测试项目，用于产生抗D免疫球蛋白混合血浆增加检测B19DNA。按照美国药品和食品管理局发布的指南，原料血浆应进行HBSAG、HiVRNA、HCV抗体和HCV RNA检测，此外，FDA还建议生产商进行B19 DNA检测，以確保血液制品的安全性，同时遵守相关法律法规，许多血液制品制造商都加入了国际血浆蛋白治疗配方，并自愿对少量混合血浆进行检测，如CSLBehring、Octopharma等公司自愿对少量混合血浆进行HiVRNA、HAVRNA、B19DNA检测。

5  检疫期管理

原料检疫期的管理是指按照试验结果提供的原料血浆生产的技术措施，并在单位血浆站提供的固结原料血浆的一段时间之后，以及再血浆的血浆样品按照测试结果进行测试。国家食品和药物管理局于2007年发布相关规定，规定原料血浆的检疫期不低于90天，即收集和测试原料血浆体90天，合格的原料血浆只能在样品的质粒血浆中进行测试和合格。2008年，进一步规定，如果血液制造商增加病毒核酸扩增检测试剂以在酶联免疫吸附测定的基础上检测血浆样品，则每日起始时间限制不小于60天。欧洲和欧洲等发展国家美国使用NAT筛查病毒筛查原料血浆，从而缩短窗口，因此，制造商本身通常使用或确定60天结账期。检疫时间管理的管理原料血浆可以有效降低缺乏的风险在窗口期间检查，这是能够有效控制到了原料血浆的有效措施之一。

6  光化学病毒灭活方法

补骨脂素光化学法是使用其化学光敏性与致病微生物的核酸或蛋白质结合，并且在光的条件下发生光化学反应，使病原体灭活并且病毒不能复制，从而有效地灭活病毒在血浆中。病毒灭活方法可以有效地灭活大多数DNA病毒，RNA病毒，脂质涂覆的病毒和非脂质涂覆的病毒在血浆中，但对于光化学的抗性细小病毒而言是无效的。因为牛奶醛光化学方法对病毒核酸直接影响，但对血浆中的其他蛋白质成分几乎没有影响，它通常用于灭活血小板和凝血因子。亚甲蓝是一种含正电荷的吩噻嗪衍生物，由Heinrich Caro于1876年首次合成。亚甲蓝化学方法是利用theraflex亚甲蓝血浆系统在轻量条件下形成单线氧或自由基，破坏原结构核酸对病原体进行杀菌，是我国唯一批准临床应用的技术，而核化学病毒的核化学方法是近年来光volumy研究的热点之一，它利用紫外光或可见光照射和氧化传递电子，仍在破坏核酸骨架以使病毒失活。该方法可以有效地灭活产物中的病原细菌，对蛋白质含量没有明显影响。核鱼素是人体的必需维生素，照明后的代谢物与人体相同。因此，通过该方法制备的血液产品对人体造成较小。一方面，它会导致核酸的突变，阻碍核酸的复制和转录，并导致蛋白质合成的失败;另一方面，自由基的生产引起光相化，导致细胞死亡和病毒失活。这种方法可以用于病毒在血小板中的灭活，但它们的失活时间影响血小板的质量，非活性时间越长，血小板损伤的变化越大，蛋白质浓度会影响灭活效果，蛋白质浓度越高的情况下会使得紫外线穿透力越弱，灭活效果越差。

7  病毒灭活/去除工艺

血液制品的病毒失活/去除过程是能够有效的防止到了血液产品中血型病毒传播的关键措施。各国监管机构发布的相关法规/指南是强制性文件，也是制造商关注的关键过程链接之一。2002年，国家食品和药物管理局发布了血液制品排毒/失活的技术方法和验证指南。显然需要在生产过程中存在某种病毒去除/灭活能力，并且在生产过程中应该有特异性病毒去除/灭活方法。一种有效可靠的病毒灭活/去除方法通常要求病毒滴度≥4病毒灭活/去除后的日志，易于模拟和确认。对于工艺条件的变化，为可以最大限度地激活或去除原血浆中可能被污染的病毒，世卫组织要求在每种产品的生产过程中采用两种或两种以上的方法对病毒进行灭活或去除，才可以有效的确保到了產品的病毒安全。目前的失活技术包括热处理（包括巴氏杀菌，干热，蒸汽加热），有机溶剂/表面活性剂（S/D）和低pH培养物。在1948年以来，巴氏杀菌已用于人血清白蛋白产品。到目前为止，已经证实了加工的人血清白蛋白作为无病毒产品，并已写入世卫组织生物制品规定，但这种方法不适用于凝血因子产品的失活，低pH孵育方法仅适用于免疫球蛋白产品的灭活当中。解毒技术包括沉淀（低温乙醇），色谱和纳米过滤。低温乙醇方法和色谱法都具有一定的解毒能力。单一应用不能完全保证病毒去除，并且需要添加其他特定病毒失活/去除方法。S/D方法首先报道于1985年，是病毒失活/去除方法的第一个飞跃，其被认为是消除包膜病毒的绝对有效的方法。1994年报道的纳滤方法是病毒失活/去除方法的第二次飞跃。该方法解决了去除甲型肝炎，B19和其他小病毒的问题，但它不适合所有血液制品，并且使用成本相对较高，这限制了该方法的应用，并确保了血液产品的病毒安全性。

8  结束语

由上可知，血液制品灭活的方法、原理以及机制等都存在了一些不同，选择科学合理的病毒灭活方法有着十分重要的意义。灭活病毒是一项艰巨的任务，为能够有效确保到血液制品的安全性，科学人员应当在灭活病毒等方面继续的努力前进。

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