干旱胁迫对不同根型苜蓿根系生长及根际土壤细菌的影响

汪 堃,南丽丽,*,师尚礼,郭全恩

1 甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室, 兰州 730070 2 甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所, 兰州 730070

苜蓿(Medicagosativa)是畜牧业生产中不可或缺的植物蛋白资源,也是我国当前草地农业和生态建设工程中应用最为广泛的草种[1],其根系类型可划分为直根型、侧根型、根蘖型和根茎型4类[2]。直根型苜蓿基因源主要来自于紫花苜蓿,根茎型、侧根型和根蘖型苜蓿都不同程度地具有野生黄花苜蓿的基因,其对干旱、严寒的抵抗力较强。

我国干旱和半干旱地区的面积约占国土面积的52.5%[3],干旱胁迫严重影响作物的生长和产量。根系是植物吸收、转化和储藏营养物质的重要器官。当出现干旱胁迫时,植物根系最先感知并迅速产生信号传递到各个器官,植物通过改变自身形态和生理生化特性以适应变化的水分环境[4],进而影响根际环境[5]。根际是受植物根系及其生长活动显著影响的土壤微域环境[6],根际微生物群落种类和数量与植物生长、繁殖密切相关[7]。干旱胁迫能调控植物根际土壤细菌群落结构和组成,使得某些功能菌群、有益菌群和有害菌群显著变化[8],对土壤生物化学活性及养分组成与转化、植物生长发育及抗胁迫能力有直接影响[9]。

目前对不同根型苜蓿根颈变化特征[10]、根系发育能力[11]、根系与产量的关系[12]、抗逆性[13- 14]进行了对比研究,但有关干旱胁迫对根系生长及根际细菌菌群结构影响的研究鲜见报道。为此,本试验设置水分胁迫处理,以幼苗期不同根型苜蓿根系生长及根际土壤为研究对象,利用16S rRNA基因测序技术对土壤中细菌种类及多样性进行系统分析,研究不同根型苜蓿根系生长及根际土壤细菌群落结构对干旱胁迫的响应,为不同根型苜蓿根际土壤菌群结构平衡、增强胁迫耐受性提供参考,为旱地苜蓿丰产、高效、优质栽培提供依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苜蓿有：Ⅰ.根茎型“清水”紫花苜蓿(rhizomatous rootedM.sativacv.Qingshui,QS)、Ⅱ.直根型“陇东”紫花苜蓿(tap rootedM.sativacv.Longdong,LD)、Ⅲ.根蘖型“公农4号”杂花苜蓿(creeping rootedM.varia Martin.cv.Gongnong No.4,GN),其中Ⅲ的种子由吉林省农科院提供,其余均由甘肃农业大学草业学院提供。

1.2 试验设计

在甘肃农业大学草业学院植物生长室,采用沙培盆栽试验,选用12 cm(高)×9.2 cm(盆底直径)塑料盆为试验用盆,每盆装用去离子水洗净、105 ℃恒温干燥箱烘48 h后的沙子1 kg,播种饱满、均匀、无病虫害的苜蓿种子35粒,播种后每盆定量浇灌300 mL Hoagland营养液,待长出两片真叶时进行间苗,每盆留苗18株。于幼苗生长至第42天始干旱胁迫。试验采用两因素完全随机设计,因素A为3个不同根型苜蓿品种；因素B为不同水分处理,分别为对照(Control,CK)、中度(Medium,M)和重度(Severe,S)水分胁迫,3个处理的土壤含水量分别为河沙最大持水量的65%—75%、45%—55%和25%—35%,即不同处理每隔2 d分别浇灌257、128、77 mL Hoagland营养液,每个处理重复4次,共36盆。处理15 d后采集苜蓿幼苗根系,抖掉根系外围河沙,用毛刷取紧贴在根系上的河沙,每个处理的所有重复混合后作为根际土,保存在-80℃冰箱中用于土壤微生物总DNA提取。

1.3 测定方法

采用烘干法测定10个植株叶茎、根系干物质量并计算根冠比(根系干物质量/叶茎干物质量),将叶茎、根系置于60 ℃的恒温干燥箱烘48 h,烘至恒重。将各处理的根系用蒸馏水冲洗干净,采用台式扫描仪对根系进行扫描并将图像存入电脑,采用WinRHIZO根系分析系统软件可以获得根系总长度、根系总表面积、根系平均直径、根体积和根尖数等。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[15]。

土壤总DNA提取及细菌16S rRNA基因扩增：采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板,根据测序区域的选择,使用带Barcode的特异引物,New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。利用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)与806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)扩增其V4区基因片段,每个样品3次重复。PCR扩增反应条件为：98 ℃预变性1 min,98 ℃变性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环,最后在72 ℃下延伸5 min。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。通过Hiseq 2500平台(Illumina,SanDiego,CA,USA)进行测序(诺禾致源生物信息科技有限公司,北京)。下机数据经过QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体后[16- 17],得到可用于后续分析的有效序列(effective tags)。

1.4 数据分析

用Excel 2003进行数据统计,用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),用Duncan法对数据进行多重比较。利用Uparse软件对样品的有效序列进行OTUs聚类(Operational Taxonomic Units,相似度97%以上),用Mothur方法[18]与Silva软件的SSUrRNA数据库[19]进行物种注释(设定阈值为0.8—1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)软件[20]进行快速多序列比对,采用Qiime(1.9.1)软件计算Alpha多样性指数,使用R软件(2.15.3)绘制稀释曲线。

2 结果与分析

2.1 各根型苜蓿根系生长差异分析

由表1可知,随胁迫程度增加,各根型苜蓿的株高、茎叶生物量、根系干重、根系活力、根体积、根系总长均显著降低(P<0.05),重度胁迫下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的株高较CK下降了21.05%、26.66%和27.29%,茎叶生物量较CK降低了31.52%、29.37%和31.99%,根系干重较CK减少了23.71%、23.22%和42.82%,根系活力较CK降低了76.63%、58.49%和75.70%,根体积较CK下降了38.15%、35.20%和49.38%,根长较CK减少了7.49%、4.47%和14.57%,且Ⅰ的株高、根系活力显著大于Ⅱ和Ⅲ(P<0.05),Ⅱ的根长显著大于Ⅰ和Ⅲ(P<0.05),Ⅱ和Ⅲ的根系干重显著高于Ⅰ(P<0.05)；不同根型苜蓿的根冠比随胁迫程度加剧呈先增加后下降趋势,在中度胁迫时达到最大值,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根冠比较CK分别增加了30.05%、32.94%和18.51%(P<0.05),且Ⅰ的根冠比显著小于Ⅱ和Ⅲ(P<0.05)；根系平均直径、根系总表面积各根型苜蓿间差异不显著；Ⅰ的根尖数随胁迫程度加剧呈先上升后下降趋势(P<0.05),而Ⅱ和Ⅲ的根尖数呈显著下降趋势(P<0.05),重度胁迫下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根尖数较CK分别降低了16.34%、24.24%和51.82%,且Ⅱ的根尖数显著高于Ⅰ和Ⅲ(P<0.05)。

2.2 根际土壤细菌群落丰度与Alpha多样性分析

由表2可知,通过高通量测序,过滤掉低质量的序列后,QS.CK、QS.M、QS.S、LD.CK、LD.M、LD.S、GN.CK、GN.M、GN.S的有效序列在55943—67703范围内变动,OTU数分别为711、785、701、645、752、707、662、658、762。由图1可知,各样品文库的覆盖度均在98%以上,并结合样品稀释曲线均趋于平缓,说明本研究测序数据合理,能够准确反映出土壤细菌群落的真实信息。各处理Chao1指数和ACE指数均在中度胁迫下最大,且处理间差异不显著；Simpson和Shannon-wiener指数各处理间差异不显著。由图2可知,所有样品共有OTUs数目为493个,其中QS.CK、QS.M、QS.S、LD.CK、LD.M、LD.S、GN.CK、GN.M、GN.S所特有的OTUs数目分别为38、384、28、26、27、21、18、25、25个。

表1 干旱胁迫对不同根型苜蓿根系生长的影响

表2 样品序列数统计、丰富度与多样性指数

图1 样品稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves for samples

图2 样品花瓣图Fig.2 Flower diagrams of samples

2.3 根际土壤细菌群落分布

由图3可知,各处理细菌群落相对丰度前十的细菌门分别为：变形菌门(Proteobacteria)(54.44%—77.59%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(1.60%—24.43%)、类杆菌门(Bacteroidota)(4.71%—13.08%)、放线菌门(Actinobacteria)(2.66%—3.38%)、厚壁菌门(Firmicutes)(1.97%—4.19%)、unidentified_Bacteria(1.47%—3.75%)、Kapabacteria(0.21%—3.53%)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(0.34%—1.93%)、蛭弧菌门(Bdellovibrio)(0.38%—1.04%)、Candidatus_Kaiserbacteria(0.02%—0.58%),共占细菌总数的92.97%—96.90%。其中变形菌门、绿弯菌门、类杆菌门、放线菌门和厚壁菌门占细菌总数的85.09%—92.40%,说明这5个门的细菌为优势菌群。不同处理细菌在门分类水平上,相对丰度有一定的差异。随胁迫程度增加,与CK相比,变形菌门、厚壁菌门、unidentified_Bacteria和Kapabacteria显著增加(P<0.05),类杆菌门、放线菌门、疣微菌门、蛭弧菌门和Candidatus_Kaiserbacteria均先增加后降低(P<0.05),而绿弯菌门显著降低(P<0.05)。

图3 门分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial community at phylum level

由图4可知,各处理细菌群落相对丰度前十的细菌属分别为：爬管菌属(Herpetosiphon)、假单孢菌属(Pseudomonas)、Pseudoxanthomonas属、副球菌属(Paracoccus)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、Shinella属、偶氮螺菌属(Azospirillum)、Devosia属、SWB02属、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium),共占细菌总属的43.05%—61.86%,其他类群的相对丰度占38.14%—56.95%。细菌在属分类水平上,各处理相对丰度有一定的差异。随胁迫程度增加,与CK相比,爬管菌属、假单孢菌属和副球菌属均显著降低(P<0.05),Pseudoxanthomonas、Devosia、SWB02和中慢生根瘤菌属均显著增加(P<0.05),纤维弧菌属、Shinella和偶氮螺菌属先增加后降低(P<0.05)。

图4 属分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at genus level

3 讨论

根系形态是描述植物根系随环境变化的重要指标。丁红等[21]研究表明,干旱胁迫下根长、根系表面积和根体积较大有利于植物大范围吸收土壤水分和养分；厉广辉等[22]和Pirnajmedin等[23]研究认为,根干重、根体积、根总面积与品种抗旱能力呈显著正相关；李文娆等[24]研究表明,干旱胁迫显著增加了紫花苜蓿根系表面积；张翠梅等[25]研究显示,干旱胁迫下强抗旱苜蓿的根系总长度和根系干重显著增加,根系总表面积变化不显著；弱抗旱苜蓿的根系总表面积显著下降。本研究显示,与CK相比,随胁迫程度加剧,各根型苜蓿的幼苗株高、地上干重、根系干重、根系活力、根系平均直径、根体积、根系总表面积、根系总长等指标均有一定程度的减少,表明干早胁迫限制了苜蓿根系和地上部的生长,降低了苜蓿的干物质积累,这与前人研究结论一致[26]；中重度水分胁迫使各根型苜蓿的根冠比增加,这与其他学者对小麦[27]、豌豆[28]、玉米[29]的研究结果一致,对朱槿[30]的研究结果相反。整个胁迫期间,根茎型清水紫花苜蓿的株高、根系活力及根尖数相对较高,直根型陇东紫花苜蓿的根长、根系平均直径、根体积、根系总表面积相对较高,根蘖型公农4号杂花苜蓿的地上干重、根系干重、根冠比相对较高。这可能是由不同根型苜蓿根系适应或响应干旱胁迫的形态差异造成,根系生长发育受到自身遗传因素和外部环境的共同影响。

研究表明,根际细菌菌群参与调控植物的环境胁迫应答[31- 33]。因而,研究细菌群落的结构,进一步筛选和接种有益菌以减轻植物适应环境胁迫的压力是一种成本效益较高的选择。土壤中绝大多数微生物是不可培养的,高通量测序能较真实地反映环境中微生物组成[34]。本研究表明,苜蓿根际土壤细菌群落主要有变形菌门、绿弯菌门、类杆菌门、放线菌门和厚壁菌门5个优势菌门。这与相关学者对水稻[35]、玉米[36]、冰川棘豆[37]等植物根部土壤细菌群落结构的研究结果类似。随胁迫程度加剧,变形菌门和厚壁菌门的相对丰度显著升高,类杆菌门和放线菌门的相对丰度先升高后下降,绿弯菌门的相对丰度显著降低。包含多种病原菌和固氮菌的变形菌门在各种植物根际增长速度很快,是各种植物根际细菌中的优势菌群[38]。变形菌还具有较好抗旱能力,特别是具有较厚的细胞壁更能抵抗水分胁迫[39],可以解释其在干旱胁迫后明显富集的现象；厚壁菌门可耐受干旱、低温等极端条件[40],干旱胁迫使其在苜蓿根系土壤中丰度显著升高；放线菌门产生的孢子能够抵抗外界不利的环境条件[41],在中度胁迫下达到了最大；绿弯菌参与C、N、S等一系列重要生源元素的生物地球化学循环过程[42],干旱胁迫降低了C、N、S等生物地球化学循环过程。可见,干旱胁迫明显影响土壤微域结构,对苜蓿根际细菌菌群的结构具有显著的调控作用,推测这些丰富度提高的优势菌群可能在干旱胁迫下,对苜蓿存活和增加胁迫耐受能力方面发挥重要作用。

4 结论

干旱胁迫对直根型、根茎型、根蘖型苜蓿的根系生长及根际土壤细菌菌群组成均有显著影响。与CK相比,随胁迫程度增加各根型苜蓿的株高、地上生物量、地下生物量、根系活力、根体积、根系总长均显著降低,根冠比先增加后下降且在中度胁迫时达到最大值。干旱胁迫均显著增加了变形菌门、厚壁菌门、unidentified_Bacteria和Kapabacteria的相对丰度,显著降低了绿弯菌门的相对丰度,但类杆菌门、放线菌门、疣微菌门、蛭弧菌门和Candidatus_Kaiserbacteria均先增加后降低。