不同时间点电针干预对心肌梗死大鼠心肌保护及干细胞因子表达的比较研究

袁晨越，施佑瑾，郭淑青，薛永鹏，牟芳芳，国海东

不同时间点电针干预对心肌梗死大鼠心肌保护及干细胞因子表达的比较研究

袁晨越，施佑瑾，郭淑青，薛永鹏，牟芳芳，国海东

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

观察不同时间点电针干预对心肌梗死（MI）大鼠外周血及心肌组织干细胞因子（SCF）含量，以及心肌组织细胞凋亡、胶原纤维沉积和血管新生的影响。采用结扎左冠状动脉前降支制作MI模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组和电针组，其中电针组又分为造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h 3个亚组，分别于相应时间点对大鼠进行电针干预，针刺“内关”“心俞”30 min，连续干预14次后取材。ELISA检测大鼠外周血和心肌组织SCF含量，TUNEL染色、Masson染色分别观察梗死区细胞凋亡及胶原纤维沉积，CD31免疫荧光染色检测梗死区和梗死周边微血管密度。与正常组比较，模型组大鼠血清和心肌组织SCF含量均明显增加；与模型组比较，电针各干预组大鼠血清和心肌组织SCF含量增加，心肌组织凋亡细胞数量和胶原纤维沉积显著降低，梗死区和梗死周边微血管密度明显升高。其中，造模后1 h电针组改善情况最明显。MI发生后1 h内电针大鼠“内关”“心俞”可有效提高大鼠外周血和心肌组织SCF含量，改善MI大鼠的预后。

心肌梗死；电针；干细胞因子；细胞凋亡；血管新生；大鼠

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心血管疾病中的急重症，45岁以下人群发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，临床上治疗MI主要包括药物溶栓、介入、手术等。然而这些治疗对梗死心肌组织修复作用有限，导致疾病后期复发维护成本大大提高。干细胞因子（stem cell factor，SCF）具有明显促进干细胞归巢和心肌细胞修复的作用。此外，SCF对祖细胞增殖与分化也起着关键的作用。因此，SCF常被应用于器官组织的损伤修复[2-3]。本研究观察不同时间点电针干预对MI大鼠外周血及心肌梗死组织SCF水平及心肌组织细胞凋亡、胶原沉积和血管新生的影响，探究不同时间点电针干预对MI预后的影响，寻找电针对MI保护及修复的最佳时机，为阐明电针保护及修复MI心肌细胞的作用机制提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级6～8周龄SD大鼠，雄性，36只，体质量（300±50）g，上海中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号SYXK（沪）2014-0008。饲养于上海中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，自由摄食饮水。所有实验均按照上海中医药大学伦理委员会和国际动物福利标准指导方针进行。

1.2 主要试剂与仪器

ELISA试剂盒（货号ml102853），上海酶联生物科技有限公司；OCT包埋剂（货号4583），美国SAKURA公司；CD31（货号ab222783），英国Abcam公司；Alexa Fluor®488山羊抗兔荧光二抗（货号ab150077），英国Abcam公司；抗荧光淬灭封片剂（货号H-1200），美国VECTOR公司；TUNEL凋亡试剂盒（货号C1088），上海碧云天生物技术有限公司；Masson三色染色液（货号BP-DL022），森贝伽生物技术有限公司；华佗牌针灸针（0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）。电针治疗仪（KWD 808I），常州英迪电子医疗器械有限公司；小动物呼吸机（7025），意大利Ugo Basile公司；多功能酶标仪（Synergy 2），美国Bio-Tek公司；冰冻切片机（HM525），美国Thermo Fisher Scientific公司；倒置荧光显微镜（IX51），日本Olympus公司。

2 实验方法

2.1 分组及造模

实验分为正常组、模型组和电针组，其中电针组又分为造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h 3个亚组。随机选取4只大鼠为正常组，不做处理。余32只大鼠参考文献[4]方法，采用结扎左冠状动脉前降支制作MI模型。随机选取6只大鼠为造模前1 h电针组，于造模前1 h进行电针预防性干预（造模前1 h电针组最终存活3只）。将除造模前1 h电针组外的10只成模大鼠随机分为模型组（4只）、造模后1 h电针组（3只）和造模后24 h电针组（3只）。

2.2 电针干预

电针组大鼠针刺“内关”（前肢内侧距腕关节约3 mm尺桡骨缝间）及“心俞”（第5胸椎下两旁肋间），将0.25 mm×13 mm无菌针灸针垂直刺入2～3 mm，行提插捻转手法，左右两侧分别连接电针治疗仪，频率20 Hz等幅疏密波，电流强度1 mA，留针30 min，每日1次。

造模前1 h电针组、造模后1 h电针组和造模后24 h电针组首次电针时间分别为造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h。然后分别于首次电针后每隔24 h电针治疗1次，共14次。正常组和模型组采用与电针组相同的固定方式但不行电针干预。

2.3 取材

电针干预结束后腹主动脉采血，4 ℃、3 000×离心5 min，取上清液。快速剪开胸廓，取出心脏，剪去心房，沿梗死区域中央将心室组织切成两部分，靠近心底部分用于常规制备冰冻组织切片，靠近心尖部分用于ELISA检测。

2.4 ELISA检测

将组织取出，称重后加入对应体积PBS，制成组织匀浆，4 ℃、5 000×离心5～10 min，取上清液。另取离心后的大鼠血清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，于酶标仪波长450 nm处测定OD值。根据标准曲线计算大鼠血清及心肌组织SCF含量。

2.5 Masson染色

取冰冻切片，0.01 mol/L PBS清洗。在组织上滴加Bouin液，置于37 ℃烘箱2 h，流水冲洗切片至黄色消失。滴加100 μL天青石蓝染色液，染色2～3 min，水洗。滴加Mayer苏木素染色液，染色2～3 min，水洗。酸性乙醇分化液处理1～2 min，流水冲洗10 min。滴加丽春红酸性品红染色液，染色10 min，蒸馏水冲洗。磷钼酸溶液处理约10 min，倾去液体，滴加苯胺蓝染色剂衬染5 min，蒸馏水冲洗，脱水和透明后中性树脂封片。观察胶原纤维沉积，计算百分比。

2.6 TUNEL染色

取冰冻切片，0.01 mol/L PBS洗2次。0.5%Triton X-100室温处理5 min，0.01 mol/L PBS洗2次。根据试剂盒说明书配制TUNEL检测液，每个样品加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。0.01 mol/L PBS洗3次，用抗荧光淬灭封片剂封片，观察高倍视野凋亡细胞数量。

2.7 CD31免疫荧光染色

取冰冻切片，0.01 mol/L PBS洗2次。正常山羊血清37 ℃处理30 min封闭非特异性结合位点。滴加一抗，4 ℃孵育过夜。0.01 mol/L PBS冲洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育1 h。0.01 mol/L PBS冲洗3次。滴加DAPI，室温染色5～10 min。0.01 mol/L PBS浸洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，观察梗死区和梗死周边微血管密度。

3 统计学方法

4 结果

4.1 电针对模型大鼠血清干细胞因子含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清SCF含量明显增加（＜0.01）；与模型组比较，电针各组大鼠血清SCF含量明显增加（＜0.05）。结果见图1。

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

4.2 电针对模型大鼠心肌组织干细胞因子含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠心肌组织SCF含量明显增加（＜0.05）；与模型组比较，电针各组大鼠心肌组织SCF含量明显增加（＜0.05，＜0.01），其中造模后1 h电针组增加最明显。结果见图2。

4.3 电针对模型大鼠心肌组织细胞凋亡的影响

MI发生后出现细胞凋亡，经电针干预后各组大鼠心肌组织凋亡细胞数量减少。造模后1 h电针组凋亡细胞数量最少，明显低于其他各组。造模前1 h电针组和造模后24 h电针组凋亡细胞数量较模型组减少，但高于造模后1 h电针组。结果见图3。

4.4 电针对模型大鼠梗死区胶原纤维沉积的影响

模型组大鼠梗死区可见大量心肌细胞被胶原纤维所取代；电针各组大鼠梗死区胶原纤维沉积明显减少。造模后1 h电针组大鼠梗死区胶原纤维沉积数量最少，明显低于其他各组。造模前1 h电针组和造模后24 h电针组大鼠梗死区胶原纤维沉积数量均低于模型组，但高于造模后1 h电针组。结果见图4。

注：与模型组比较，##P＜0.01；与造模后1 h电针组比较，△P＜0.05

注：与模型组比较，**P＜0.01；与造模后1 h电针组比较，##P＜0.01

4.5 电针对模型大鼠心肌组织梗死区血管新生的影响

CD31免疫荧光染色显示，与模型组比较，造模后1 h电针组和造模前1 h电针组大鼠梗死区和梗死周边微血管密度显著升高（＜0.01，＜0.05），造模后1 h电针组大鼠梗死区和梗死周边微血管密度明显高于造模前1 h电针组和造模后24 h电针组（＜0.05，＜0.01）。结果见图5。

注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与造模后1 h电针组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

5 讨论

中医认为，MI基本病机为本虚标实，本虚以阳虚、气虚为主，标实则以血瘀最为重要。气虚血瘀是贯穿MI的关键病理基础。研究表明，“内关”“心俞”两穴对缺血性心脏病心肌细胞具有较好的保护作用[5]。内关为手厥阴心包经络穴，也是连通阴维脉的八脉交会穴。《备急千金要方》有“凡心实者，则心中暴痛……惕然不能动……内关主之”。心俞是心之背俞穴，背俞穴作为脏腑之气灌注于背部的穴位，与相应脏腑联系密切。《针灸甲乙经》对其有“寒热心痛……与背相引而痛”的论述。两穴临床治疗MI应用广泛。有研究发现，两穴改善心功能方面具有一定协同治疗作用[6-7]。

心肌细胞作为终末分化的成熟细胞，当遇到缺血缺氧等病理状况时会发生大量凋亡。正常情况下，心肌细胞凋亡有利于清除受损细胞，对体内微环境平衡及新细胞产生具有促进作用[8]。但病理状态下大量心肌细胞凋亡会加重心肌组织受损。研究表明，心肌细胞凋亡是导致MI心功能减退和病理性心肌重构的重要因素，梗死区面积大小与MI发生后心肌细胞凋亡程度密切相关[9]。因此，MI早期抑制心肌细胞凋亡将有效减少梗死面积，改善预后。本实验发现，电针各组大鼠心肌组织凋亡细胞数目减少，梗死区胶原纤维沉积明显降低。其中以造模后1 h电针组凋亡细胞数量和梗死区胶原纤维沉积最少，造模前1 h电针组和造模后24 h电针组凋亡细胞数量和梗死区胶原纤维沉积虽高于造模后1 h电针组，而较模型组降低。提示MI发生后较早电针干预可改善大鼠缺血状态下心肌组织坏死，同时表明，MI发生前电针预防对抑制缺血心肌组织损伤具有一定作用。

与心肌细胞凋亡相对应的是MI梗死区和梗死周边血管新生[10]，新生血管对恢复血流和改善心肌细胞缺血缺氧状态具有重要意义[11-12]。研究发现，血管新生机制与抗细胞凋亡之间可能存在某种交叉作用[13-14]。本实验发现，与模型组比较，造模后1 h电针组和造模前1 h电针组大鼠梗死区和梗死周边微血管密度显著升高，其中造模后1 h电针组微血管密度最高。本实验结果表明，MI发生前后短时间电针刺激大鼠“内关”“心俞”可有效促进其心肌组织梗死区及梗死周边血管新生，有利于改善MI大鼠预后。

SCF是c-kit配体，对细胞分化、生长、归巢等有重要的调控作用。MI发生后心肌组织的梗死区通过产生部分趋化细胞因子吸引循环干细胞进入并介导心肌组织再生，参与损伤修复[15]。本实验发现，电针MI大鼠“内关”“心俞”后，大鼠外周血及心肌组织SCF含量较模型组明显增加，推测可能与电针促进干细胞向缺血区“归巢”机制有关[16]。同时还发现，造模后1 h电针组大鼠心肌组织SCF含量高于造模后24 h电针组，提示病理情况下早期电针干预更有利于机体调动自身的干细胞，从而尽可能维持机体内环境平衡。而电针预防也可对MI大鼠心肌缺血损伤起到一定的保护作用。

综上所述，MI发生后短时间内电针大鼠“内关”“心俞”可有效提高大鼠血清及心肌组织SCF含量，改善预后。在MI发生前电针大鼠“内关”“心俞”可对大鼠MI损伤起到一定的预防作用。此外，我们推测，电针刺激加快了循环干细胞向缺血区“归巢”并介导心肌组织的再生，抑制心肌细胞凋亡并促进梗死区和梗死周边血管新生。

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Comparative Study on Effects of Electroacupuncture at Different Time Points on Myocardial Protection and Stem Cell Factor Expression in Rats with Myocardial Infarction

YUAN Chenyue, SHI Youjin, GUO Shuqing, XUE Yongpeng, MOU Fangfang, GUO Haidong

To observe the effects of electroacupuncture at different time points on the contents of stem cell factor (SCF) in peripheral blood and myocardial tissue, and myocardial cell apoptosis, collagen fibers deposition and angiogenesis in rats with myocardial infarction (MI).A model of MI was established by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. Experimental rats were randomly divided into normal group, model group, and electroacupuncture group. Electroacupuncture group was divided into three subgroups (1 hour before modeling, 1 hour after modeling and 24 hours after modeling). Rats were treated with electroacupuncture at corresponding time points. The electroacupuncture group was treated with acupuncture at “Neiguan” and “Xinshu” for 30 min for 14 times. The contents of SCF in peripheral blood and myocardial tissues were detected by ELISA. TUNEL and Masson staining were used to observe cell apoptosis and collagen fibers deposition in the infarct area. CD31 immunofluorescence staining was used to detect the microvessel density around the infarct and the infarct area.Compared with the normal group, the SCF content in serum and myocardial tissue of the model group significantly increased. Compared with the model group, the SCF content in serum and myocardial tissue increased, the number of apoptotic cells and the deposition of collagen fibers in myocardial tissue decreased, the microvessel density around the infarct and the infarct area significantly increased in the electroacupuncture intervention groups. Theimprovement in electroacupuncture group of 1 hour after modeling was the most obvious.Electroacupuncture at acupoints of “Neiguan” and “Xinshu” within 1 hour after MI can effectively increase the content of SCF in the peripheral blood and myocardial tissue, thus improving the prognosis of rats with MI.

myocardial infarction; electroacupuncture; stem cell factor; apoptosis; angiogenesis; rats

R245

A

1005-5304(2021)10-0070-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102018

国家自然科学基金（81673729、81704157）

国海东，E-mail：hdguo@shutcm.edu.cn

（收稿日期：2021-02-01）

（修回日期：2021-02-12；编辑：华强）