基于指纹图谱的四神丸多成分质量控制研究

魏伟，侯建忠，朱顺娟，盛雪燕，郭华荣

基于指纹图谱的四神丸多成分质量控制研究

魏伟1，侯建忠1，朱顺娟1，盛雪燕2，郭华荣1

1.酒泉市药品检验检测中心，甘肃 酒泉 735000；2.酒泉市人民医院，甘肃 酒泉 735000

建立四神丸HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法，并结合聚类分析和主成分分析对其进行质量评价。采用InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长230 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，对不同厂家的14批四神丸样品进行质量分析。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算相似度，确定共有特征峰。利用SPSS20.0和SIMCA-P11.5软件对确定的共有特征峰进行聚类分析和主成分分析，评价样品间的质量差异，并对10种成分进行含量测定。建立了四神丸的HPLC指纹图谱，确定30个共有峰，指认了其中10个特征峰，14批样品与对照指纹图谱的相似度为0.967～0.996。对补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢二异丁香酚进行含量测定，方法学考察结果均符合要求。聚类分析和主成分分析可将14批四神丸样品分为四类，结果提示同一厂家样品基本可归为一类，不同厂家样品差异较大。本研究建立的四神丸指纹图谱专属性强，含量测定结果准确可靠，可用于四神丸的鉴别和整体质量控制，并为其质量标准的修订提供依据。

四神丸；指纹图谱；高效液相色谱法；聚类分析；主成分分析；质量控制

四神丸是治疗五更泻的名方，主要由肉豆蔻（煨）、补骨脂（盐炒）、五味子（醋制）、吴茱萸（制）组成，功效温肾散寒、涩肠止泻[1]，临床广泛用于脾肾阳虚型泄泻、溃疡性结肠炎、肠易激综合征等[2]。

目前，受中药材质量、生产工艺等因素的影响，中药制剂质量存在较大差异。苏建等[3]利用HPLC同时测定四神丸中7种有效成分含量，结果样品各成分含量差异较大。乌曰根等[4]基于指纹图谱技术分析四神丸中吴茱萸的有效成分，但未深入研究指纹图谱所含信息。现行标准以补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素总量控制制剂质量[1]，无法充分反映四神丸多成分协同发挥药效的特征。指纹图谱结合多指标成分定量分析，不仅可鉴别真伪，还可通过主要特征峰的定量测定，实现制剂质量的全面控制[5]。本研究通过对6个厂家14批四神丸HPLC图的全面分析，建立指纹图谱，并测定补骨脂主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素，五味子有效成分五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲，吴茱萸有效成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱，肉豆蔻有效成分去氢二异丁香酚的含量，进一步采用聚类分析和主成分分析归类比较不同批次样品差异，以期完善四神丸的质量评价标准，提升质量控制水平。

1 仪器与试药

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器），安捷伦科技（中国）有限公司；XP205DR型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司。

对照品五味子醇甲（批号110857-201815，纯度99.7%）、五味子甲素（批号110764-201915，纯度99.5%）、五味子乙素（批号110765-201813，纯度99.1%）、五味子酯甲（111529-201706，纯度95.2%）、补骨脂素（批号110739-201918，纯度99.6）、异补骨脂素（批号110738-202016，纯度99.4%）、吴茱萸碱（批号110802-201710）、吴茱萸次碱（批号110801-201608，纯度99.7%）、去氢二异丁香酚（批号111838-201804，纯度98.6%），中国食品药品检定研究院；对照品五味子醇乙（批号B21323，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，水为自制超纯水。四神丸样品购自当地药店和京东大药房（样品信息见表1），阴性样品所需饮片由酒泉市神舟药业有限公司提供，经甘肃省药品检验研究院马潇主任中药师鉴定，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）规定，由酒泉市中医院制剂室按药典方法制备。

表1 14批四神丸样品信息

编号生产厂家规格批号 S1山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20170802 S2山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20191001 S3山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20191202 S4山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20200202 S5山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20200501 S6山西华康药业股份有限公司9 g×6袋20200801 S7北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司27 g/瓶19080106 S8北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司27 g/瓶20080043 S9河南省康华药业股份有限公司6 g×10袋20071701 S10河南省康华药业股份有限公司6 g×10袋20071801 S11孔圣堂（唐山）制药有限公司60 g/瓶200302 S12孔圣堂（唐山）制药有限公司60 g/瓶200304 S13药都制药集团股份公司9 g×10袋190501 S14洛阳顺势药业有限公司9 g×10袋20200901

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

分别精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢二异丁香酚对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.415、0.504、0.539、0.522、0.637、0.468、0.462、0.329、0.388、0.414 mg/mL的对照品贮备液，分别精密量取上述对照品贮备液1.00 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2.1.2 供试品溶液

取四神丸样品适量，研细（过100目筛），取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液

按2020年版《中华人民共和国药典》（一部）“四神丸”项下处方量和制法分别制备缺肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸的阴性样品，各取1.0 g，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件

采用InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，40%B；5～25 min，40%～30%B；25～45 min，30%B；45～50 min，30%～15%B；50～70 min，15%B），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长230 nm，进样量10 μL。各成分色谱峰理论板数均不低于4 000。

2.2.2 精密度试验

取同一批四神丸样品（S2），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰，以吴茱萸碱色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.15%、相对峰面积RSD≤1.51%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验

取同一批四神丸样品（S2）6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰，以吴茱萸碱色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.22%、相对峰面积RSD≤1.82%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

取同一批四神丸样品（S2），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱峰，以吴茱萸碱色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.38%、相对峰面积RSD≤1.64%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 相似度评价

取四神丸样品（S1～S14）粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。将14批样品色谱数据导入《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012版），采用中位数法，设定时间窗为0.10，经多点校正、全谱峰匹配后生成对照指纹图谱（R），确定30个共有峰，结果见图1。将样品指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度评价，14批样品指纹图谱相似度均大于0.96，结果见表2。表明四神丸样品整体较为相似，差异较小。

图1 14批四神丸样品指纹图谱叠加图

2.2.6 共有峰确认及归属

取“2.1.1”“2.1.3”项下溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，见图2。与对照品色谱图和对照指纹图谱比对，共确定10个共有特征峰。

表2 14批四神丸样品指纹图谱相似度评价结果（r）

编号相似度 编号相似度 编号相似度 S10.993 S60.992 S110.981 S20.994 S70.996 S120.987 S30.991 S80.989 S130.983 S40.992 S90.976 S140.969 S50.993 S100.967

注：1.补骨脂素；2.异补骨脂素；3.五味子醇甲；4.吴茱萸碱； 5.五味子醇乙；6.吴茱萸次碱；7.五味子酯甲；8.去氢二异丁香酚； 9.五味子甲素；10.五味子乙素

2.3 含量测定

2.3.1 线性关系考察

分别精密量取“2.1.1”项下对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置25 mL量瓶中，制成系列浓度混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录各色谱峰峰面积。以各对照品浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和线性范围，结果见表3。10种成分在相应范围内线性关系良好。

表3 10种成分线性关系考察结果

成分回归方程相关系数线性范围/（μg/mL） 补骨脂素Y＝34.264X＋113.010.999 83.33～16.64 异补骨脂素Y＝31.526X＋119.8671.000 04.03～20.17 五味子甲素Y＝8.206X＋44.0980.999 54.29～21.46 五味子乙素Y＝49.56X＋159.070.999 94.18～20.88 五味子醇甲Y＝49.397X＋234.4120.999 05.08～25.41 五味子醇乙Y＝61.132X＋59.8470.999 53.74～18.72 五味子酯甲Y＝61.467X＋137.040.999 73.52～17.61 吴茱萸碱Y＝111.87X＋384.030.999 62.63～13.15 吴茱萸次碱Y＝41.686X＋81.8990.999 83.10～15.52 去氢二异丁香酚Y＝151.53X＋190.760.999 63.31～16.56

2.3.2 精密度试验

精密量取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果各对照品峰面积RSD≤0.86%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批四神丸样品（S2）6份，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，结果各对照品峰面积RSD≤1.12%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取同一批四神丸样品（S2），按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果各对照品峰面积RSD≤1.20%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

取已知含量的四神丸样品（S2）粉末约1.0 g，精密称定6份，分别加入混合对照品溶液2 mL，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，分别计算各成分的回收率。结果补骨脂素、异补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢二异丁香酚的平均回收率分别为98.39%、100.01%、99.56%、92.08%、97.99%、97.62%、96.98%、99.05%、95.68%、98.61%，RSD分别为1.20%、1.81%、1.78%、2.75%、1.39%、1.54%、2.63%、1.96%、2.34%、1.05%，表明该方法回收率良好。

2.3.6 样品含量测定

取四神丸样品（S1～S14）粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算样品中补骨脂素、异补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢二异丁香酚的含量，结果见表4。

表4 14批四神丸样品中10种成分含量测定结果（mg/g，n＝3）

编号补骨脂素异补骨脂素五味子甲素五味子乙素五味子醇甲五味子醇乙五味子酯甲吴茱萸碱吴茱萸次碱去氢二异丁香酚 S12.202.050.420.821.860.270.180.680.300.09 S22.172.070.390.811.830.250.180.680.300.09 S32.212.140.430.811.860.260.160.690.310.09 S42.232.200.410.781.880.260.170.690.320.09 S52.132.060.430.841.900.290.160.680.310.09 S62.202.060.400.801.830.260.180.660.300.09 S71.841.710.310.671.530.220.190.210.120.07 S81.601.660.240.631.500.170.150.200.100.05 S91.911.940.090.391.160.200.070.300.120.02 S102.032.060.480.601.230.150.090.260.110.11 S112.081.940.310.551.490.180.080.960.410.07 S122.121.980.330.571.410.180.100.980.410.07 S131.461.440.280.821.790.190.160.110.110.06 S141.671.590.220.651.200.130.260.540.200.05

2.4 化学计量学分析

2.4.1 聚类分析

将14批四神丸样品指纹图谱的共有峰峰面积导入SPSS20.0软件，以峰面积为变量，采用最远邻元素法，以平方Euclidean距离为度量标准进行聚类分析，结果见图3。当距离为10时，14批样品可分为四类：S1～S8、S13为第一类，S9、S10为第二类，S11、S12为第三类，S14为第四类。表明同一厂家的样品基本可聚为一类，不同厂家样品间差异较大。

图3 14批四神丸样品聚类分析树状图

2.4.2 主成分分析

为进一步区分和评价四神丸样品，以所测得的10种成分含量为变量，导入SPSS20.0软件进行主成分分析，结果见表5、表6。以特征值和方差贡献率为依据，可提取3个主成分，其累积贡献率达83.759%，表明3个主成分包含指纹图谱的主要信息。由载荷绝对值可知，补骨脂素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对第1主成分的载荷值较大，五味子酯甲和五味子乙素对第2主成分的载荷值较大，去氢二异丁香酚对第3主成分的载荷值较大，表明四神丸质量的差异性是多个成分共同影响的结果。运用SIMCA-P11.5软件进行分析，结果见图4。14批样品中，S1～S8、S13为一类，S9、S10为一类，S11、S12为一类，其余为一类，与聚类分析结果一致。

表5 四神丸样品中10种成分含量主成分分析特征值和方差贡献率

成分初始特征值 提取平方和载入 合计方差/%累积/% 合计方差/%累积/% 14.18141.81441.814 4.18141.81441.814 22.70026.99868.812 2.70026.99868.812 31.49514.94783.759 1.49514.94783.759 40.717 7.17190.930 50.659 6.58897.518 60.160 1.60199.119 70.056 0.55699.675 80.020 0.19799.872 90.012 0.11999.991 100.001 0.009100.000

表6 四神丸样品中10种成分主成分载荷矩阵

成分成分1成分2成分3 补骨脂素0.803-0.489-0.046 异补骨脂素0.696-0.550-0.026 五味子醇甲0.6700.670-0.120 吴茱萸碱0.770-0.538-0.059 五味子醇乙0.5320.444-0.651 吴茱萸次碱0.791-0.429-0.146 五味子酯甲0.5320.7060.298 去氢二异丁香酚0.232-0.2160.912 五味子甲素0.5980.1290.133 五味子乙素0.6400.6900.302

图4 14批四神丸样品主成分分析

3 讨论

四神丸化学成分复杂，为使其成分信息能够最大程度被谱图表征出来，本试验供试品溶液制备方法比较了加热回流提取法、超声波提取法、索氏提取法，提取溶媒比较了甲醇、水和不同比例甲醇水溶液，综合提取效率、结果稳定性等因素，确定提取条件为甲醇50 mL超声提取30 min。

本试验先采用二极管阵列检测器进行190～400 nm全波长扫描，结果在230 nm波长处谱图信息最为全面，基线较平稳。随后比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等流动相的洗脱效果，通过对流动相比例和时间的调整，最终确定“2.2.1”项下色谱条件最佳。

中药制剂成分复杂，仅对某些成分进行含量测定无法全面反映其内在质量。四神丸以补骨脂补命门之火为君，以肉豆蔻温中涩肠、五味子酸敛固涩、吴茱萸辛热补火燥湿为臣，佐以生姜温胃散寒、大枣益气补中。在刘昌孝院士等[6]提出的中药质量标志物基础上，查阅文献发现，补骨脂具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎及神经保护等作用，补骨脂素和异补骨脂素有抗骨质疏松、神经保护、抗肿瘤、抗炎等药理作用，且具有肝脏毒性，为指标成分[7]；肉豆蔻具有止泻、抗炎等多种功效，去氢二异丁香酚是主要活性成分[8-9]；五味子木质素类成分具有抗炎、抗心肌缺血、抗氧化、肝保护等作用，联苯环辛二烯类木脂素类成分五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素为五味子的质量标志物[10]，五味子甲素、五味子酯甲可作为鉴别南、北五味子的标志物[11]。吴茱萸中生物碱是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎镇痛、胃黏膜损伤保护作用，吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素为指标成分[12]。

本试验采用HPLC对14批四神丸样品进行分析，建立了指纹图谱，并测定了补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢二异丁香酚10种成分的含量，聚类分析和主成分分析结果基本一致，建立的指纹图谱和含量测定方法准确，可为四神丸质量标准的提升和完善提供参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2020：829-830.

[2] 李雪莹,王佐梅,姚欣卉,等.四神丸药理作用及临床应用研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2021,23(4)：122-126.

[3] 苏建,刘永利,郭毅,等.多波长HPLC法同时测定四神丸中7个有效成分的含量[J].药物分析杂志,2013,33(9)：1531-1537.

[4] 乌曰根,王阳.基于指纹图谱技术分析四神丸中吴茱萸的有效成分[J].世界中医药,2017,12(12)：3351-3157.

[5] 祝明,陈碧莲,石上梅.中药指纹图谱技术在中国药典2015年版一部中的应用[J].中国现代应用药学,2016,33(5)：611-614.

[6] 刘昌孝,陈士林,肖小河,等.中药质量标志物(Q-Marker)：中药产品质量控制的新概念[J].中草药,2016,47(9)：1443-1457.

[7] 杨阔,高茸,马亚中,等.补骨脂素药理作用及肝毒性机制的研究进展[J].中草药,2021,52(1)：289-298.

[8] 袁子民,刘欢,王静.肉豆蔻及炮制品醇提取物的止泻及抗炎作用研究[J].时珍国医国药,2015,26(12)：2910-2911.

[9] 马存,冼少华,相雨,等.肉豆蔻药理作用研究进展[J].中国现代中药, 2017,19(8)：1200-1206.

[10] 任伟光,张翠英.五味子的研究进展及质量标志物(Q-marker)的预测分析[J].中草药,2020,51(11)：3110-3116.

[11] 郭丽,杨忠杰,于晓涛,等.南、北五味子药材的HPLC指纹图谱建立及化学模式识别分析[J].中国药房,2020,31(18)：2224-2229.

[12] 刘丽,张笑敏,许浚,等.吴茱萸化学成分和药理作用及质量标志物(Q-marker)的预测分析[J].中草药,2020,51(10)：2689-2702.

Study on Quality Control of Multi-components inPills Based on Fingerprints

WEI Wei1, HOU Jianzhong1, ZHU Shunjuan1, SHENG Xueyan2, GUO Huarong1

To establish the HPLC fingerprints and multi-component content determination method ofPills; To evaluate its quality by cluster analysis and principal component analysis.Totally 14 batches ofPills from different manufacturers were analyzed by InertSustain C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with methanol-0.1% phosphoric acid acqueous solution as mobile phase, gradient elution. Detection wavelength was 230 nm; flow rate was 1.0 mL/min; column temperature was 35 ℃. Chinese Medicine Choromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 edition) was used to calculate similarity and determine common peaks. SPSS 20.0 and SIMCA-P 11.5 software were used for cluster analysis and principal component analysis, quality differences between samples were evaluated. The contents of 10 components were determined.The HPLC fingerprints ofPills were established. There were 30 common peaks, and 10 peaks were identified. The similarity between the samples and the control fingerprint was 0.967–0.996. The contents of psoralen, isopsoralen, schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin, γ-schisandrin, schisantherin A, evodiamine, rutaecarpine, and dehydrodiisoeugenol were determined and the methodological investigation results met the requirements. 14 batches ofPills could be divided into four groups by cluster analysis and principal component analysis. The results showed that the samples from the same manufacturer could be basically divided into one category, and the differences among the samples from different manufacturers were relatively large.The fingerprints ofPills is specific, accurate and reliable, which can be used for the identification and overall quality control ofPills, and can provide the basis for the revision of the quality standard.

Pills; fingerprints; HPLC; cluster analysis; principal component analysis; quality control

R284.1

A

1005-5304(2021)10-0105-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104215

甘肃省药品科研项目（2020GSMPA021）

郭华荣，E-mail：1542118804@qq.com

（收稿日期：2021-04-12）

（修回日期：2021-05-06；编辑：陈静）