复合酶酶解对谷物杂粮粉体外消化率的影响

马丽媛*，狄冰倩，贺馨颖，逯本涵，仁青拉姆，徐硕

绥化学院，食品与制药工程学院（绥化 152061）

中国“五谷养身”的传统饮食文化延续几千年。近年来，养生和食品营养日益受到人们关注，在中国除大米和面粉以外的粮食作物均被称作粗粮或杂粮。以五谷杂粮为原料制成的养生营养食品具有很高的营养价值与保健功能[1-2]，逐渐被大众认可和接受，并迅速发展成前景广阔的朝阳食品产业[3-4]。

近年来人们对谷物粉的研究多集中在婴幼儿配方米粉上[5-7]，随着科学技术发展和人民生活水平提高，谷物粉的研究逐渐向其他人群倾斜[8]，至今中国对谷物杂粮粉的体外消化率研究仍有空缺，还有待进一步探索。市场上多采用滚筒干燥技术和挤压膨化技术来生产谷物杂粮粉，但用这2种工艺生产的杂粮粉，冲调时易结块，且黏度较大，食用后不易消化，导致其中的营养成分不能被有效吸收。为解决营养成分难吸收的问题，通过复合酶水解技术改善谷物杂粮粉的消化性能，使谷物杂粮粉中的营养成分能被更好地吸收利用，为谷物杂粮粉的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 材料与试剂

小米、玉米、红豆、黑米、燕麦（均为市售）；氢氧化钠（沧州邦之德化工产品有限公司）；次甲基蓝（湖北鑫润德化工有限公司）；酒石酸钾钠、亚硫酸钠（河北科隆多生物科技有限公司）；亚铁氰化钾（河南瑞仁生物工程有限公司）；苯酚（山东创利新材料有限公司）；葡萄糖（安徽宏通生物工程有限公司）；硫酸铜（济南铭德化工有限公司）；3,5-二硝基水杨酸（上海鼓臣生物技术有限公司）；α-淀粉酶（北京奥博星生物技术有限公司）；β-淀粉酶、中性淀粉酶脂肪酶、纤维素酶、猪胰酶（上海祥瑞生物科技有限公司）。

1.1.2 仪器与设备

高速多功能摇摆式粉碎机（青岛密克朗粉体机械有限公司）；HH-6型恒温水浴锅（上海高致精密仪器有限公司）；YP102N电子天平（浙江赛德仪器设备有限公司）；GZX-9240型电热恒温鼓风干燥箱（上海右一仪器有限公司）；YGL-12型高速冷冻离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；UV1902PC型紫外可见分光光度计（东莞博莱德仪器设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 谷物杂粮粉加工工艺流程及操作要点

原料除杂→粉碎→过筛→杂粮粉混合→调浆→灭酶→冷却→添加酶→酶解→灭酶→冷却→过滤→测定淀粉体外消化率

1) 原料选择：选取颗粒饱满、无虫蛀、无霉点的新鲜谷物杂粮，清除其中沙石等杂物。

2) 粉碎：用超微万能粉碎机进行粉碎，过0.150 mm孔径筛网，备用，用密封袋保存，避免受潮。

3) 混合：谷物杂粮粉按1∶1∶1∶1∶1质量比进行混合。

4) 调浆：按底物质量分数5%加水调成浆液。

5) 灭酶：于95 ℃恒温水浴灭酶10 min，冷却至酶解温度，调节pH。

6) 添加酶：控制酶添加量0.05%，并进行搅拌，使得浆液与酶能够充分接触，在恒温水浴锅中水解一定时间，水解过程中不断搅拌。

7) 灭酶：水解结束后于95 ℃灭酶10 min，冷却。

8) 过滤：采用4层滤布过滤，滤液于电热恒温鼓风干燥箱中烘干，称其质量，记录总干物质含量。

9) 淀粉消化率测定：采用淀粉消化指数（Starch digestibility index，SDI）表示淀粉体外消化速率。

1.2.2 谷物杂粮粉的体外消化率测定

采用模拟体外消化的试验方法，测定谷物杂粮粉的淀粉体外消化速率。根据Englyst等[9]按淀粉消化特性进行划分，用淀粉消化指数（SDI）表示淀粉体外消化速率。

称取5 g上述谷物杂粮粉基料，放入250 mL烧杯中，加入50 mL蒸馏水、10 mL pH 7.2的磷酸缓冲溶液，置于37 ℃水浴中保温5 min，加入0.4 mL 1%猪胰酶。酶解12 h后在沸水浴中加热5 min使酶失活，冷却，按5000 r/min离心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中定容，用3,5-二硝基水杨酸法测定酶解液中还原糖含量。平行操作3次，得出还原糖含量平均值。按式（1）计算。

式中：SDI为淀粉体外消化速率，%；G为淀粉水解产生的最大葡萄糖含量（以水解12 h后葡萄糖含量计算）；F为理论上淀粉水解成葡萄糖含量，g[10]。

1.2.3 单因素试验

以谷物杂粮粉的淀粉体外消化率为指标，分别考察酶的种类（α-淀粉酶、β-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶）、复合酶比例（3∶7，4∶6，1∶1，6∶4和7∶3）、酶解时间（30，60，90，120和150 min）、酶解温度（45，50，55，60和65 ℃）、底物浓度（3%，4%，5%，6%和7%），通过单因素试验来确定复合酶水解谷物杂粮粉的酶解工艺。

1.2.4 响应面试验

由单因素试验结果选择对试验指标影响较大的3个因素的适宜水平，进行响应面试验，以淀粉体外消化率为参考指标，对其工艺参数进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果2.1.1 不同种类的酶对谷物杂粮粉体外消化率的影响

由图1可知：α-淀粉酶的酶解产物高于其他4种酶，其淀粉体外消化率为30.24%，其次是β-淀粉酶，其淀粉体外消化率为29.44%，因为2种酶对谷物杂粮粉水解程度较高，剩余的中性蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶的效果均不及上述2种酶。参考季慧等[11]α-淀粉酶与β-淀粉酶对米粉水解的影响，试验决定仿照其试验方法，选择效果最佳的2种酶进行复配，可增加酶催位点，使反应更加快速高效。试验将这2种类型的酶进行复合，研究其对谷物杂粮粉的体外消化率的影响。

图1 不同酶制剂对谷物杂粮粉体外消化率的影响

2.1.2 复合酶比例对谷物杂粮粉体外消化率的影响

由图2可知：α-淀粉酶和β-淀粉酶的复配比例随着α-淀粉酶增加曲线呈现上升趋势，当两者比例相等，为1∶1（图中5∶5）时谷物杂粮粉的体外消化率值最高，但α-淀粉酶比例大于β-淀粉酶时曲线呈现下降趋势。这是因为α-淀粉酶作用于淀粉分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，能够在短时间内将淀粉长链大分子降解成短链小分子，形成小分子质量的糊精，从而提高谷物杂粮粉的消化性能[12]。糊化后的淀粉，随着温度降低，淀粉分子重新缔合会出现回生现象，形成的结晶性结构不能被淀粉酶水解，从而影响淀粉的消化性能。相关研究表明，β-淀粉酶通过切断谷物杂粮粉直链淀粉外侧支链，能够有效抑制淀粉回生，防止消化性能的降低[6,13]。试验表明2种酶复合酶比例1∶1（图中5∶5）时，谷物杂粮粉的消化率为40.05%，达到最大值。

图2 复合酶质量比对谷物杂粮粉体外消化率的影响

2.1.3 酶解时间对谷物杂粮粉消化率的影响

由图3可知：体外消化率随着酶解时间延长逐渐增加，酶解时间30～60 min时，呈现急速上升趋势，酶解时间60～120 min时，体外消化率值呈现平稳上升趋势，酶解时间120 min时体外消化率达到最大，酶解时间120～150 min时呈现下降趋势，这是因为酶解时间120 min内复合酶与淀粉分子之间发生充分作用，酶促反应较剧烈，酶解时间超过120 min后酶的活力开始下降，同时随着酶解时间增加，底物被酶解而逐渐减少，酶解效果也随之减弱。因此酶解时间120 min较为合适。

图3 酶解时间对谷物杂粮粉消化率的影响

2.1.4 酶解温度对谷物杂粮粉体外消化率的影响

由图4可知，体外消化率值随着酶解温度升高呈现先增加后减少趋势，在酶解温度45～55 ℃时，体外消化率持续上升，酶解温度55 ℃时，体外消化率值最大。这是由于β-淀粉酶和α-淀粉酶都属于中温性的酶类，酶解温度55 ℃时，酶表现出较强的活力。酶解温度55～60 ℃时，谷物杂粮粉体外消化率值呈现下降趋势，这是因为酶解温度过高或过低，都会影响复合酶的结构及活性，进而影响谷物杂粮粉中淀粉的水解程度。因此选择酶解温度为55 ℃。

图4 酶解温度对谷物杂粮粉体外消化率的影响

2.1.5 底物浓度对谷物杂粮粉体外消化率的影响

由图5可知：随着底物浓度不断增加，体外消化率呈现先增加后下降趋势，底物浓度5%时，测得的体外消化率值最大；但是随着底物浓度逐渐增加，谷物杂粮粉体外消化率值有所下降，这是因为底物浓度较低时，反应速率增加较快；但是随着底物浓度逐渐增加，底物与底物之间出现竞争关系，出现竞争性抑制，从而影响水解程度。因此底物浓度选取5%。

图5 底物质量分数对谷物杂粮粉体外消化率的影响

2.2 响应面试验结果

根据单因素试验结果可知：酶解时间、底物浓度、酶解温度3个因素对淀粉体外消化率影响较大，所以选择这3个因素进行响应面试验，以淀粉体外消化率为参考指标，选择最优组合。

2.2.1 数学模型构建及显著性分析

响应面试验设计根据表1进行，共17组，其中12组为析因试验，研究各因素之间的交互作用，5组为中心试验，用以估算试验误差。试验结果如表1所示。

表1 响应面试验设计与结果

利用Design Expert软件分析试验结果，经回归拟合，得到二次多项式回归方程：Y=0.53682-0.01128A-0.00870B-0.01680C-0.11437A2-0.02062B2-0.13427C2+0.02843AB-0.04383AC+0.01033BC，对回归方程进行方差分析，如表2所示。

由表2可知：该回归模型p＜0.0001，失拟项p=0.0699＞0.05，说明失拟不显著，即该模型的响应值预测良好。同时，回归模型的R2=0.9970，表明所建立的模型可以解释99.70%的响应变化，Radj2=0.9932，表明该模型能解释99.32%响应值的变化。说明模型具有高度显著性，残差由随机误差引起，试验误差小，试验拟合较好。回归方程可用于确定谷物杂粮粉酶解工艺最优参数的理论预测及结果分析，能够真实反映各因素与响应值之间的线性关系。

表2 响应面试验结果方差分析表

2.2.2 响应面优化与分析

根据二次多项式回归方程，绘制响应面图，如图6所示。

图6 SDI值的响应曲面图

三维响应曲面图能直观地反映各单因素及其交互作用对响应值的影响程度，响应面越陡，表明该因素对响应值影响越显著[14-15]。由图6可以看出，3种因素及其交互作用对响应值SDI影响的顺序为AC（酶解时间和酶解温度）＞AB（酶解时间和底物质量分数）＞C（酶解温度）＞A（酶解时间）＞BC（底物质量分数和酶解温度）＞B（底物质量分数）。

通过软件对响应值进行优化，得到酶解最优工艺参数：底物质量分数4.7%、酶解时间117.9 min、酶解温度54.7 ℃，模型方程预测SDI值为53.89%。结合实际操作局限性，将工艺参数修正为底物质量分数5.0%、酶解时间118.0 min、酶解温度55.0 ℃。通过3组平行验证试验（53.10%，54.00%和53.80%），SDI为53.63%±0.3859%，与方程理论预测值基本一致。

3 结论

通过研究酶解对谷物杂粮粉体外消化率的影响，得出酶解最佳工艺配方参数：复合酶（α-淀粉酶和β-淀粉酶）质量比1∶1，底物质量分数4.7%、酶解时间117.9 min、酶解温度54.7 ℃，此时得出的SDI值为53.89%。随着谷物杂粮粉SDI值提高，谷物杂粮粉组织状态得到改善，含有丰富的营养且利于人体吸收，符合当代人膳食需求。