大蒜提取物超氧化物歧化酶对酱腌菜品质影响

韩晓磊，梁珏钦，杨慧，王龙泉，熊智，吕慧英

1.湖南省农业科学院农产品加工研究所（长沙 410125）；2.湖南省食品测试分析中心（长沙 410125）；3.湖南省农业信息与工程研究所（长沙 410125）；4.西南林业大学（昆明 650224）

酱腌菜是腌菜和酱菜等的总称[1]，蔬菜制品经过酱、盐、糖、醋等腌制加工后的产品称为酱腌菜[2]。酱腌菜作为居民日常生活饮食的传统开胃小菜和休闲食品，具有鲜甜脆嫩或咸鲜辛辣等独特味道，受到大众欢迎。采摘后蔬菜瓜果的生长代谢和腌制中微生物作用是亚硝酸盐产生的主要来源[3]，在加工腌制中在细菌还原酶等作用下，大量的硝酸盐被还原为亚硝酸盐，易导致过量的亚硝酸盐累积，从而使食用安全性和产品营养品质大幅下降[4]，长期食用过量的亚硝酸盐是引发人体急慢性中毒和癌症的重要诱因[5]。近年来，酱腌菜亚硝酸盐超标事件时有发生，严重威胁大众身体健康。我国大蒜资源非常丰富，大蒜除含有硫胺素、核黄素、尼克酸、蒜素等化学物质外，还可以通过酶解和化学反应产生多种活性成分，如中二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物以及超氧化物歧化酶等，使得大蒜具有广谱抗菌消炎、抗癌等生理功效[6-10]。超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在天然动植物体内的酸性蛋白，近年来研究表明大蒜中含有较为丰富的SOD，而且利用效率较高[11]，为大蒜提取物在果蔬抑菌、保鲜和对亚硝酸盐降解等方面提供重要的原料基础，研究其抗菌保鲜具有现实意义。目前，对亚硝酸盐的降解主要集中在人工接种发酵以及添加抗氧化剂等方面，多数是利用大蒜提取液中挥发油、汁及浸出液中所含有大蒜素、大蒜辣素等成分进行亚硝酸盐等有害成分降解[12-16]。有研究表明大蒜SOD还可作为抗氧化剂有效防止罐头、果汁等食品的变质及腐败现象[17]。而大蒜SOD清除亚硝酸盐以及对酱腌菜腌制中积累的亚硝酸盐进行清除和贮藏中营养品质影响的研究还未见相关报道。

试验以大蒜为基础原料，利用不同提取方法，采用实验室检测手段，探究其SOD提取物对酱腌菜亚硝酸盐清除效率和营养品质影响规律，以期在酱腌菜生产贮藏中开发一种来源广泛且安全无毒的天然抗菌保鲜剂，为保障酱腌菜安全和营养品质健康和大蒜综合利用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂、设备

材料：新鲜大蒜（白皮、紫皮）；青菜、白菜等腌制蔬菜原料，精制食盐及腌制瓷罐等材料均为市售，原料采购后于4 ℃冰箱冷藏保存备用。

试剂：木瓜蛋白酶（2000 U/mg），东恒华道生物科技有限责任公司；三羟甲基氨甲基烷（99.5%）、焦性没食子酸（99.0%）、DPPH（Sigma D9132-100 mg 97%）、亚硝酸盐标准样品、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、浓硫酸、盐酸、磷酸、三氯甲烷、乙醇、活性炭、硼砂等，试验中所用试剂均为分析纯，用水均为去离子水。

主要仪器与设备：AL-204型电子天平，美国梅特勒-托利多公司；UV-1700紫外可见光分光光度计，日本岛津；PHB-4型pH计，雪磁；HR/T16M型高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；电子恒温水浴锅、超纯水系统、台式离心机、酸碱滴定管、榨汁机、磁力搅拌器等。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜SOD活性测定

采用邻苯三酚自氧化法测定。SOD酶活性定义：在1 mL反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%时的酶量为一个活性单位。酶活力值表示：酶活力（U/g）=[（ΔA325-ΔA′325）×100%×4.5×2×D×V1/（ΔA325×V×m1）]。式中：ΔA325为邻苯三酚自氧化速率；A′325为样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V为加入样液或酶液体积，mL；D为酶液或样液稀释倍数；V1为样液总体积，mL；m1为样品的质量，g。

1.2.2 大蒜SOD提取物抗氧化能力测定

采用紫外分光光度法测定，以提取物对DPPH自由基清除效率表示抗氧化能力，其清除率计算公式：清除率=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100%。式中：Ai为未加大蒜提取物时溶液的吸光度；Aj为加入大蒜提取物后溶液的吸光度；A0为大蒜提取液的吸光度[18]。

1.2.3 亚硝酸盐和营养品质指标测定

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，并以清除率为衡量指标。清除率计算公式：清除率=（A1-A2）/A1×100%；式中：A1为未加大蒜提取物时的吸光度；A2为加入大蒜提取物时的吸光度。

菌落总数参照GB 4789—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》方法测定，可溶性糖采用蒽酮比色法测定，总酸采用GB/T 123456—2008中酸碱滴定法测定，氨基酸态氮测定采用GB/T 13662—2008中滴定法测定。

2 提取与测定

2.1 大蒜SOD提取物的制备与纯化

采用磷酸缓冲液法对白皮大蒜、紫皮大蒜（各2000 g样品）进行提取，首先将蒜瓣去外膜，于搅拌机搅拌10 min，然后移至研钵中研磨至蒜泥状，加入2倍样品体积的50 mmol/L磷酸盐缓冲液和5 g木瓜蛋白酶，用榨汁机使其组织破碎后匀浆。在40 ℃恒温搅拌器上搅拌35 min，调至pH 6，在4 ℃条件下浸提过夜，用6层纱布抽滤，如此反复共3次，收集3次抽滤所得初滤液，以6000 r/min离心10 min，得上清液。采用热变性法、丙酮沉淀法对提取的粗酶液进行纯化。将粗酶液分成两份，一份于60 ℃热处理10 min，以8500 r/min离心10 min，另一份加入0.6倍体积的丙酮，搅拌15 min。两份分别于旋转蒸发器浓缩并于45 ℃热风干燥至粉末状，得到纯化的大蒜SOD提取物[17]，分别测定提取物抗氧化能力及酶活力值。

2.2 酱腌菜的制备与提取物的添加

以大白菜、青菜共5 kg为原料，洗净杀青、沥干，按照传统工艺腌制，均匀分成5份，每份添加12%的精制食盐，混匀，装入编号为A1～A5的5个腌制瓷罐中，分别添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%质量分数的大蒜SOD提取物于瓷罐中，混匀，压紧盖上瓷盖，并以纯净水水封密封，此腌制试验共三平行，保存在恒温培养箱（25 ℃）中腌制，分别于5，10，15，20和30 d取出适量待测样品，测定亚硝酸盐质量分数及清除效率；将腌制30 d后的A1样品均匀分成5等份，共2平行，对应添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%质量分数的大蒜SOD提取物，混匀，真空包装后于室内常温贮藏，分别于0，10，20，30，40，60和90 d对菌落总数、总酸、可溶性糖、氨基酸态氮进行的测定，每个试验重复3次，测定结果以平均值表示，分析其结果。

3 结果与分析

3.1 大蒜SOD提取物抗氧化能力测定

DPPH是一种稳定的有机自由基，溶于乙醇时溶液呈深紫色，该溶液在波长517 nm处有强的吸收。当有自由基清除剂存在时，可与其单电子配对使其溶液褪色吸收降低，其褪色程度与其所接受的电子数呈线性关系，因此可以用光度法检测自由基的清除情况，从而评价自由基清除剂即样品的抗氧化能力[18]。试验时，共三平行，准确吸取5 mL的提取液于10 mL比色管中，然后加入2.0 mL 0.8 mg/mL DPPH溶液，用水定容至刻度，在室温下反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度。由图1可知，两种提纯方法大蒜SOD提取物对DPPH均具有较强的清除能力，且对DPPH清除率均随大蒜提取物用量的增大而增强，具有较明显的量效关系，大蒜SOD提取物对DPPH清除力大排序为磷酸缓冲液法+丙酮沉淀法＞磷酸缓冲液法+热变性法＞磷酸缓冲液法。

3.2 大蒜SOD提取物酶比活力值测定

由表1可知，两种不同大蒜样品经过不同提取纯化方法得到的大蒜提取物SOD酶比活力均有不同，但品种间SOD活力值差异不显著（p＞0.05），回收率均较好，经过热变性和丙酮沉淀法，总蛋白浓度下降，总酶活力升高；酶比活力值排序为为磷酸缓冲液法+丙酮沉淀法＞磷酸缓冲液法+热变性＞磷酸缓冲液法。综合图1和表1分析可知，应选用白皮大蒜经过磷酸缓冲液法+丙酮沉淀法提取物作为此次试验高活性大蒜SOD来源，对酱腌菜亚硝酸盐降解及营养品质影响进行的相关试验。

图1 大蒜SOD提取物对DPPH的清除率

表1 大蒜SOD提取物酶比活力值

3.3 大蒜SOD提取物对酱腌菜腌制中亚硝酸盐质量分数及清除效率影响

GB 2714—2015《酱腌菜》规定亚硝酸盐应符合GB 2762—2017中污染物限量值，故亚硝酸盐质量分数（以NaNO2计）应≤20 mg/kg。试验将0～30 d定义为腌制时间。由图2可知，空白组亚硝酸盐质量分数呈先升高后下降的趋势，在腌制第10天左右亚硝酸盐达到峰值，随着腌制贮藏时间的延长，亚硝酸盐质量分数快速下降，并在腌制期30 d后达到安全值范围，处理组亚硝酸盐质量分数下降程度在腌制期0～30 d呈显著差异（p＜0.05），其中0.3%和0.5%组在第5天开始就能有效降低亚硝酸盐质量分数，有效抑制亚硝酸盐峰值质量分数，在20 d左右就能使腌制酱腌菜亚硝酸盐质量分数达到安全值范围，并在后期持续抑制亚硝酸盐质量分数。各处理组均对亚硝酸盐有一定的清除效率，清除率在15 d内随样品中添加大蒜SOD提取物浓度的升高而上升，15 d后由于亚硝酸盐质量分数很低以及添加物的消耗，清除效率减弱，0.3%和0.5%添加物与其余组清除率呈显著差异（p＜0.05）。综合所述，在酱腌菜腌制过程中，选用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物对积累的亚硝酸盐清除较为理想。

图2 大蒜SOD提取物对酱腌菜亚硝酸盐质量分数降解及清除效率影响

3.4 大蒜SOD提取在酱腌菜贮藏期间菌落总数的变化

试验研究的贮藏时间为腌制完成的样品经包装未杀菌处理贮藏90 d内考察试验结果。由表2可知，空白组在40 d已变质，而添加0.3%和0.5%水平添加物酱腌菜在60 d后才出现变质现象，且菌落总数与CK，0.1%和0.2%呈显著差异（p＜0.05），酱腌菜制品卫生标准规定菌落总数小于1～3×104CFU/g，0.3%和0.5%水平在60 d内符合安全卫生标准，可有效抑制微生物的生长，延长包装后未经杀菌的酱腌菜的贮藏时间至60 d左右。

表2 酱腌菜贮藏期菌落总数变化 单位：CFU/g

3.5 不同浓度大蒜SOD提取物对酱腌菜贮藏期间氨基酸态氮影响

氨基酸态氮是由酱腌菜中微生物发酵消耗酱腌菜本身蛋白质所产生的，为微生物的生长代谢提供能量，微生物过度繁殖会导致氨基酸态氮质量分数降低，破坏酱腌菜的营养价值，生成的代谢副产物也会影响酱腌菜的风味[19]，由图3可知，氨基酸态氮（以氮计）随着酱腌菜贮藏时间的延长总体呈现下降趋势，处理组各浓度均能减缓下降趋势，但由于0.1%和0.2%浓度较低，减缓趋势不明显，而0.3%和0.5%能够有效抑制氨基酸态氮的快速下降，并且在60 d内维持在0.5 g/100 g以上水平，两者差异不明显（p＞0.05），故综合成本等因素考虑，选用0.3%～0.5%大蒜SOD提取物较为合适。

图3 酱腌菜贮藏期氨基酸态氮质量分数变化

3.6 不同浓度大蒜SOD提取物对酱腌菜贮藏期间总酸影响

酱腌菜中总酸质量分数增加主要是因为乳酸菌发酵产生乳酸，还有一些酵母菌发酵产生丁酸等酸性物质，使酱腌菜pH降低[19]，由图4可知，试验各组酱腌菜样品贮藏期间总酸质量分数随贮藏时间的延长而增加，由于空白样品无任何添加，总酸质量分数上升最快，0.1%和0.2%提取物虽然能抑制总酸的增加，因其浓度较低，效果不明显，而0.3%和0.5%可以有效抑制总酸质量分数的增加，在60 d内仍能抑制在1.0 g/100 g以内，符合酱腌菜安全卫生标准。

图4 酱腌菜贮藏期总酸质量分数变化

3.7 不同浓度大蒜SOD提取物对酱腌菜贮藏期间可溶性糖影响

由图5可知，酱腌菜在腌制过程中可溶性糖质量分数整体呈下降趋势，这是因为酱腌菜中微生物利用糖类进行发酵产酸，导致可溶性糖质量分数不断降低。但随着腌制时间的延长，环境pH降低，乳酸菌的生长和代谢均受到抑制，其对营养物质的吸收能力也随之降低，可溶性糖质量分数的降低相对缓慢下来，最后逐渐趋于稳定。0.3%和0.5%处理组在40 d内抑制可溶性糖质量分数下降与CK，0.1%和0.2%组呈显著差异（p＜0.05），但两者差异不明显，故采用0.3%～0.5%提取物较为合适。

图5 酱腌菜贮藏期可溶性糖质量分数变化

4 讨论

目前大量研究以及实践表明大蒜中天然富含大量超氧化物歧化酶（SOD），从大蒜中提取SOD成本比较低廉，近年来大蒜加工行业发展迅猛，加工副产物的利用得到很好的发展，为大蒜SOD提取提供了丰富的资源基础。目前大量的研究集中在对大蒜中大蒜素等物质的提取及抗氧化、抗菌等活性的研究，而未涉及对超氧化物歧化酶的提取，对提取物应用于酱腌菜降亚硝酸盐和改善营养品质方面也缺乏。在消费者日趋注重产品的安全和营养品质的时代，酱腌菜在腌制过程中很容易导致亚硝酸盐的积累，如何控制腌制阶段亚硝酸盐成为关键，此次试验的创新点在于在试验范围内，采用常用的实验室提取手段对大蒜SOD进行提取，并测定酶活性和对亚硝酸盐的清除效率，模拟传统腌制工艺，在未添加任何防腐剂的情况下，研究其对酱腌菜营养品质变化规律，找到清除亚硝酸盐、改善营养品质的较好的提取物浓度和贮藏时间。由于此次试验提取物浓度范围有限以及对实验室模拟酱腌菜腌制贮藏过程与实际企业生产存在较大差距，所以下一步研究方向将对提取工艺进行优化，还应结合企业实践中对酱腌菜腌制的工艺类型以及增加提取物浓度范围进行进一步探讨。

5 结论

试验结果表明，选用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物对酱腌菜进行处理，能有效降低腌制过程中亚硝酸盐质量分数，降低亚硝酸盐积累风险，而且能有效减少营养品质流失，理论上在常温条件下延长未经杀菌处理的酱腌菜贮藏期，其贮藏时间到60 d左右仍能达到品质较好，菌落总数、总酸以及氨基酸态氮质量分数均呈现较好水平。此次试验为酱腌菜生产企业开发天然保鲜剂及提高酱腌菜产品品质提供了理论依据与指导。