气相色谱法同时测定糕点中丙酸和脱氢乙酸

刘志鹏，杨李胜，王小鹏，黄敏兴，余构彬，陈其钊

1.广东省科学院生物工程研究所（广州 510316）；2.中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心（广州 510316）

为了延长食品的保藏期限，人们在食品加工过程中采用添加防腐剂的手段使微生物失去活性，延缓或阻止其生长。许多研究表明，丙酸和脱氢乙酸均为低毒高效的防腐剂，能通过改变膜的通透性，从而使微生物失活，对霉菌、细菌具有很好的抑制作用[1-2]。因此经国家批准两者可作为食品添加剂用于食品防腐，多用于糕点中使用。然而长期食用添加过量的食品，容易会引起肝、肾和中免疫系统的损伤造成贫血和免疫功能下降[3-4]，更有研究表明，长期摄入丙酸容易引起儿童易怒、不安、注意力不集中和睡眠障碍[5]。国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了上述两种添加剂在糕点中的最大使用量分别为2.5 g/kg和0.5 g/kg[6]。

现阶段丙酸和脱氢乙酸的检测方法有：比色法[7-8]、气相色谱法[9-12]、液相色谱法[13-16]、气相色谱串联质谱法[17-20]、液相色谱串联质谱法[21-22]、离子色谱法[23]。其中比色法检出限高，不能满足日常对低浓度样品的准确定量。质谱法虽然灵敏度高，定性准确，但前处理繁琐，溶剂消耗大，使用成本高，不利于推广。目前检测食品中丙酸和脱氢乙酸的国标方法分别是GB 5009.121—2016《食品中脱氢乙酸的测定》和GB 5009.120—2016《食品中丙酸钠、丙酸钙的测定》[24-25]。前者第一法为气相色谱法，后者第一法为液相色谱法，两者仪器不同，前处理方法也不一样，若需要同时检测两种物质，试验操作起来费时费力。因此，开拓研究一种能同时检测糕点中丙酸和脱氢乙酸的高效方法是国内外食品检测亟需解决的问题。

研究通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GCFID），系统考察色谱柱类型、初始温度、沉淀剂、盐酸加入量以及萃取溶剂种类对糕点中丙酸和脱氢乙酸提取和分离的影响，建立一种前处理简单，灵敏度高，能够快速、准确地同时检测两种物质的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验中所用到的糕点均为市场销售产品；脱氢乙酸、丙酸：（纯度＞99.5%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；七水合硫酸锌、氢氧化钠、盐酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、乙醚、无水乙醚：分析纯，广州化学试剂厂；乙酸乙酯、正己烷、甲醇、甲苯：色谱纯，美国默克公司；试验用水均为一级用水。

Agilent 7890A气相色谱仪：配FID检测器，美国AgilentTechnologies公司；TLE204E电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；H1850R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；S22H超声波清洗机，致微（厦门）仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取丙酸、脱氢乙酸标准物质各0.1000 g，溶于100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，配制成丙酸-脱氢乙酸标准混合储备液（1.0 mg/mL）。

1.2.2 工作曲线的配制

分别准确吸取丙酸-脱氢乙酸标准混合储备液0.01，0.1，0.5，1.0和2.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释并定容，配制成质量浓度为1.00，10.0，50.0，100和200 μg/mL标准工作液。

1.2.3 样品前处理

称取2～4 g糕点置于50 mL的离心管中，加入约15 mL蒸馏水于离心管、2.5 mL质量浓度为120 g/L的硫酸锌溶液，用质量浓度为20 g/L的氢氧化钠溶液调pH至7.5，超声提取15 min，转移至25 mL容量瓶中，加水定容。样液移入离心管中，以4500 r/min离心5 min。取10 mL上清液，加1 mL（1+1）盐酸溶液酸化后，准确加入5.0 mL乙酸乙酯，振摇2 min，放入离心机，以4000 r/min离心3 min，取约1 mL上清液于进样瓶，用气相色谱仪测定。

1.2.4 气相色谱条件

色谱柱：HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温条件：初始温度为80 ℃，始温停留1 min，后以15 ℃/min到230 ℃保持 2 min，运行13 min后 再以3 ℃/min的升温速度升温至240 ℃，保留3 min；进样口温度：250 ℃；载气：N2（纯度99.9995%），流量：1.1 mL/min（恒流模式）；隔垫吹扫流量：3 mL/min；FID检测器温度：300 ℃；空气流量：400 mL/min；氢气流量：30 mL/min；进样模式：不分流进样；进样量：1 μL。

1.3 数据处理

采用Agilent7890A气相色谱仪系统软件ChemStation对样品进行定量定性，用Excel对数据进行处理分析，色谱图用Origin绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

在相同仪器条件和分析条件下，对同一浓度标准溶液试验了HP-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、DB-35（30 m×0.32 mm×0.25 μm）及HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）不同极性色谱柱对丙酸、脱氢乙酸的分离效果。结果表明，HP-1色谱柱无法分离出丙酸和脱氢乙酸。在DB-35色谱柱中丙酸和脱氢乙酸的响应较小，有不同程度的拖尾，峰形对称性较差。HPFFAP色谱柱分离丙酸和脱氢乙酸的响应最高，峰型效果最好，与李霞等[26]的试验结果一致。这是由于丙酸和脱氢乙酸是强极性有机酸，根据相似相溶的原理，选择强极性色谱柱HP-FFAP分离丙酸和脱氢乙酸的效果最好。

2.1.2 程序升温初始温度的选择

由于丙酸和脱氢乙酸整体响应不高，为了提高检出限，需要采用不分流进样。但较大的进样体积，容易产生溶剂效应，会使目标峰变宽。为了减少溶剂效应，选择4个较低的初始温度进行试验，如图1～图4所示。结果表明初始温度为50 ℃时，峰形最为尖锐，但是程序升温时间较长，且杂峰较多；初始温度为80 ℃时峰形依然尖锐，无拖尾，杂峰少，升温时间较短；当温度升到100 ℃时，峰形较宽较矮且对称性较差，有拖尾现象；初始温度为150 ℃时响应值最差，峰形矮胖，拖尾严重，同时丙酸与溶剂峰重叠，没有实现基线分离。综合考虑，程序升温的初始温度选80 ℃为最佳。

图1 初始温度为50 ℃的色谱图

图2 初始温度为80 ℃的色谱图

图3 初始温度为100 ℃的色谱图

图4 初始温度为150 ℃的色谱图

2.2 样品前处理的优化

2.2.1 沉淀剂的选择

按1.2.1，在阴性糕点样品中加入丙酸和脱氢乙酸混合储备液，使得上机样品溶液理论质量浓度为50 mg/L，考察硫酸锌溶液与亚铁氰化钾+乙酸锌溶液两种不同沉淀剂对试验结果的影响。由表1可见：两种沉淀剂对试验结果影响的差别不大，使用硫酸锌溶液作为沉淀剂时，脱氢乙酸的回收率要略高于亚铁氰化钾搭配乙酸锌溶液作为沉淀剂时的回收率。试验过程中观察到使用硫酸锌时，样品更聚集底部，上层液更清澈。综上，对于糕点样品，沉淀剂宜选用硫酸锌溶液。

表1 不同沉淀剂对丙酸和脱氢乙酸回收率的影响（n=3）

2.2.2 盐酸溶液用量的选择

丙酸与脱氢乙酸在食品中大多数以钠盐或者钙盐的形式存在，无法直接用气相色谱仪检测，因此需要在前处理过程中加入适量盐酸使其完全转化为对应的有机酸，从而准确定量。如图5所示：试验结果表明，当不加盐酸或者加入量（0.5 mL）不够时，丙酸与脱氢乙酸的回收率很低甚至为0，推测是因为盐酸量不足，难以中和前处理过程中使用的氢氧化钠，无法让丙酸与脱氢乙酸顺利酸化，而当盐酸加入量超过1 mL后，两者回收率没有随着加入量的增加而增加。因此，为了减少无机酸对进样口及气相色谱柱的损坏和减少试剂成本，选择1 mL的盐酸溶液加入量。

图5 （1+1）盐酸溶液加入量对回收率的影响

2.2.3 萃取溶剂的选择

按1.2.1，在阴性糕点样品中加入丙酸和脱氢乙酸混合储备液，前处理的最后，分别选择甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醚作为萃取溶剂进行加标回收试验。如图6所示：甲苯、乙酸乙酯作为萃取溶剂时，丙酸与脱氢乙酸均有比较理想的回收率，乙醚和正庚烷则不能满足试验要求。考虑试剂毒性和成本，宜选用乙酸乙酯作为方法的萃取溶剂。

图6 不同萃取溶剂对回收率的影响

2.3 线性范围、检出限与定量限

将1.2.2配制好的丙酸-脱氢乙酸工作曲线进行上机分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果如表2所示，两者相关系数均大于0.999，这说明丙酸与脱氢乙酸在1～200 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。以目标峰高等于3倍基线噪音为检出限，等于10倍基线噪音为定量限。试验结果得出，在称样量为3.00 g，丙酸添加量为24 μg和78 μg以及脱氢乙酸添加量为1.8 μg和6 μg时，其对应的信噪比分别等于3和10。因此丙酸的检出限与定量限分别为0.008 g/kg和0.026 g/kg，脱氢乙酸的检出限与定量限分别为0.0006 g/kg和0.0020 g/kg，均低于国标方法，说明本方法具有一定优越性。

表2 丙酸和脱氢乙酸的线性关系、检出限、定量限

2.4 加标回收率和精密度试验

按1.2.1方法，向杏仁饼、小面包、沙琪玛三种不同基质样品中分别加入三组不同水平浓度的标准溶液进行回收率试验和精密度试验，结果见表3～表5。丙酸在三种样品中的回收率和SRSD范围分别为88.2%～92.7%和2.16%～3.88%。脱氢乙酸在三种样品中的回收率和RSD范围分别为96.2%～107.1%和0.92%～3.52%。能满足日常检验要求。

表3 杏仁饼样品中丙酸和脱氢乙酸的回收率及精密度（n=6）

表4 小面包样品中丙酸和脱氢乙酸的回收率及精密度（n=6）

表5 沙琪玛样品中丙酸和脱氢乙酸的回收率及精密度（n=6）

2.5 方法在实际样品检测中的应用以及与国标方法的比较

将该方法运用到从市场随机购买回来的60份样品中进行检测。对比两种物质所对应的不同国标检测方法，试验过程中能明显感受到该方法具有的效率优势，仅需要一次简单的前处理，便能高效、准确地定量出两种防腐剂的含量。结合GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》判定，样品的实际检出情况为：丙酸检出率为8.3%，不合格率为0%；脱氢乙酸的检出率为71.7%，不合格率为1.7%。取其中一份丙酸与脱氢乙酸均为阳性的小面包样品进行方法与国标方法的比较试验，试验结果如表6所示。由此可见，该方法与两种国标方法的试验结果无显著差异。

表6 与国标方法的比较试验（n=6）

3 结论

研究通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GCFID）建立了同时检测糕点中丙酸和脱氢乙酸的方法。解决了目前检测这两种最为常用的防腐剂时，需要两种大型仪器，两种不同前处理方法的麻烦。该方法前处理简单、安全可靠、灵敏度高、准确度和精密度满足要求，为糕点中丙酸和脱氢乙酸的检测提供多一种选择。