miR-22-3p/5p抑制小鼠成肌细胞增殖的功能研究

盖 凯，丛百林，陈 鹏，齐晓龙，邢 凯，王相国，肖龙菲，

倪和民，郭 勇，杨佐君*，盛熙晖*

(北京农学院 动物科学技术学院，北京102206)

在骨骼肌生长发育过程中，肌肉前体细胞通过分裂增殖和细胞分化，成肌细胞的迁移、相互黏附与融合产生多核肌纤维，最后通过进一步分化形成骨骼肌。microRNAs(miRNAs)，一类非编码核糖核酸，已被发现在动物骨骼肌发育过程中发挥重要作用，例如miR-378a、miR199a和miR-206等[1-3]。mmu-miR-22定位于小鼠11号染色体，其前体可以产生2个成熟miRNA，即分别从前体的5’和3’端加工而来的miR-22-5p和miR-22-3p。研究表明，miR-22-5p/3p是很多癌症的诊断标记物,分别与急性心肌梗塞[4]、乳头状甲状腺癌[5]、短暂性脑缺血[6]、卵巢癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]和非小细胞肺癌[10]等相关，但在骨骼肌发育过程中二者发挥的生物学功能尚不明确，具体的作用机制和调控网络尚未彻底阐明。为了研究mmu-miR-22-3p/5p在骨骼肌细胞生长发育过程中的作用，选择可以在低血清诱导条件下分化为多核肌管的小鼠成肌细胞(C2C12)作为细胞模型，通过转染mmu-miR-22-3p/5p的模拟物，应用CCK-8法与流式细胞术两种方法研究mmu-miR-22-3p/5p在小鼠成肌细胞在增殖过程中的作用，探究miR-22-3p/5p的生物学功能，目的是阐明miRNAs调控家畜骨骼肌生长发育的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

C2C12细胞购自于国家试验室细胞资源共享平台。mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模拟物由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染试剂脂质体Lipofectamine 2000和细胞裂解液Trizol均采购于美国Invitrogen公司。OPti-MEMI低血清培养基购自美国Gibco公司。细胞增殖-毒性检测试剂盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自北京索莱宝科技有限公司。实时荧光定量PCR试剂购自北京宝日医生物技术有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 C2C12细胞培养、总RNA提取和实时荧光定量PCR C2C12细胞培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于温度37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养。在细胞增殖的第2、3、4 天收集细胞，加入800 μL Trizol，样品裂解后加氯仿，分层后提取细胞总RNA，每个时间点设置3 个重复。加入1 μL buffer 电泳检测RNA完整性，利用紫外分光光度计测定纯度和浓度，当A260/A280比值为1.9～2.1时说明RNA的浓度和纯度合格。利用实时定量PCR技术检测mmu-miR-22-3p/5p在C2C12细胞增殖的过程中表达的情况增殖的过程中表达的情况，以U6作为内参基因，引物序列为：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；mmu-miR-22-3p 的引物序列为5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；mmu-miR-22-5p的引物序列为5′-AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′。退火温度为60 ℃，所有反应均设置3个复孔和3次技术重复，采用2 -△△Ct法计算相对表达量。

1.2.2 细胞转染 将处在对数生长期的C2C12细胞接种至6 孔的细胞培养板中，密度为1×105个/孔。转染前1 d，将培养基更换为不含血清的高糖DMEM，使转染时的细胞密度达65% ～ 70%。24 h后，按照lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染。首先用OPti-MEMI分别稀释mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模拟物和lipofectamine 2000，混匀后离心。将二者充分混匀后制为50 nm的转染剂，室温静置。将培养基换为含10 %血清的高糖DMEM，逐滴缓慢加入转染试剂，将其置于培养箱中培养6 h。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 将含有10 %FBS的高糖DMEM培养基加入96 孔板中，用转染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模拟物后的C2C12细胞铺板，细胞密度为1×103个/孔。每隔24 h将待测孔培养基更换为不含有血清的高糖DMEM并加入CCK-8试剂(10∶1)，培养基与试剂充分混匀后，将板放入37 ℃、5 % CO2的培养箱中培养2 h。2 h后取出96孔板并使用锡纸避光，使用多功能酶标仪450 nm检测待测时间(24、48、72、96 h)的OD值，得到结果后绘制曲线图。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 将C2C12细胞转移至6孔细胞培养板中，每孔加入含有10 %FBS的高糖DMEM培养基，转染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模拟物(1×105个/孔)。转染30 h后收集细胞，加入1 mL预冷PBS溶液洗涤两次后离心4 min(1 000 r/min)，弃其上清液；加入1 mL预冷的75 %乙醇，于4℃下固定4 h以上，离心5 min(1 000 r/min)后弃上清液。再用3 mL预冷PBS洗涤2次后加入0.5 mL的PL溶液染色，混匀后使用流式细胞仪480 nm激光对红光通道荧光信号进行检测，细胞周期百分比利用MODifitLT软件进行分析。

使用SPASS 25.0的单因素方差分析进行统计学分析，结果以“平均数±标准差”表示。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 C2C12细胞增殖过程mmu-miR-22-3p/5p的表达情况

利用qRT-PCR方法检验mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p在增殖期C2C12细胞中的表达情况。结果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均有表达，其中mmu-miR-22-3p在C2C12细胞中第3天表达量降低，但差异不显著；第4天表达量显著升高(P<0.05)(图1-A)。mmu-miR-22-5p在C2C12细胞中表达逐步升高，在不同时间点的表达量差异均显著(P<0.05)(图1-B)。

2.2 利用CCK-8法检测mmu-miR-22-3p/5p对C2C12细胞增殖的影响

将转染mmu-miR-22-3p/5p模拟物和mmu-miR-NC的C2C12细胞铺板于96孔板中，分别在24、48、72、96 h应用多功能酶标仪检测450 nm波长下的OD值。结果如图2所示，转染mmu-miR-22-3p模拟物组的OD值在24、48、72、96 h时均极显著低于mmu-miR-NC对照组(P<0.01)(图2-A)；转染mmu-miR-22-5p模拟物组的OD值在24 h显著低于mmu-miR-NC对照组(P<0.05)，72 h极显著低于mmu-miR-NC对照组(P<0.01)(图2-B)，即转染mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p对C2C12细胞的增殖过程具有不同程度的抑制作用。

2.3 利用流式细胞术检测细胞周期

转染mmu-miR-22-3p/5p模拟物和mmu-miR-NC 30 h后，收集C2C12细胞。用75 %乙醇固定、PL染色液染色后在4 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪480 nm检测细胞周期。结果如图3所示，转染mmu-miR-22-3p模拟物组中处于G0G1期的细胞数极显著高于对照组(P<0.01)；处于G2M期和S期的C2C12细胞数低于对照组，与对照组相比差异极显著(P<0.01)(图3A)。转染mmu-miR-22-5p模拟物组中处于G0G1期和G2M期的细胞数显著高于对照组(P<0.05)；处于S期的C2C12细胞数量低于对照组，但差异不显著(图3-B)。结果表明，在C2C12细胞中过表达的mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均使细胞在增殖过程中于S期受到阻滞，与对照组相比增殖能力降低。

3 讨 论

动物骨骼肌在维持其机体正常功能中发挥着重要作用，更与畜禽动物的产肉性能和生产效率息息相关，因此挖掘畜禽动物骨骼肌生长发育的调控基因、解析其遗传机制意义重大。骨骼肌细胞的发育过程复杂，包括体节细胞和成肌细胞的增殖、分化、迁移等环节，最终使得肌管成熟形成不同类型的肌纤维，其中涉及到众多遗传因子的网络式调控以及基因表达。目前，已经发现了调控骨骼肌细胞发育的若干主效基因，例如转化生长因子β超家族(TGF-β)促进TGFBR的表达从而调控骨骼肌细胞的增殖及分化[11]；肌细胞增强因子2家族(MEF2)可调控成肌细胞分化的高低[12]；生肌调节因子家族(MRFs)控制重要的肌肉特异性蛋白质(如肌球蛋白重链和肌肉肌酸激酶)的转录[13]等，但有关骨骼肌生长发育的分子机制尚未被完全阐明。miRNAs作为遗传通路里的微调基因或控制开关，已有众多研究结果表明miRNAs能够对骨骼肌的增殖与分化等过程进行调控。例如miR-1、miR-206和miR-133等被称为肌肉特异性miRNA，可以在骨骼肌和心肌组织中特异表达。其中，miR-1[14]与miR-206[15]均可促进组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的靶基因表达，进而调控肌肉分化；miR-133通过调控MAML1和IGF-1R等靶基因的表达在成肌细胞的增殖过程发挥作用[16-17]。miRNAs除了能够调节骨骼肌细胞的增殖之外，研究发现还可以通过调控靶基因表达促使骨骼肌细胞的凋亡等过程。例如miR-16可以靶向抑制因子Foxo1和基因Bcl2的转录，调控骨骼肌细胞的凋亡[18]。虽然miRNA在骨骼肌细胞的研究成果显著，但是调控骨骼肌生长发育的miRNA网络仍然有待完善。

大量研究表明，miR-22-3p可在不同的癌症以及其他疾病中发挥生物学功能。在患有卵巢早衰的患者中，miR-22-3p的表达水平显著低于对照组[19]；miR-22-3p可通过下调亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的表达，在叶酸缺乏引起的肝癌细胞中发挥作用[20]；miR-22-3p及其靶基因eIF4E结合蛋白基因(eIF4EBP3)之间的相互作用可用于靶点改善临床子宫颈癌的治疗[21]；miR-22-3p通过靶向调节细胞因子信号转导抑制因子3 (Socs3)的表达抑制妊娠期糖尿病小鼠肝脏胰岛素抵抗的发生[22]。另有研究发现miR-22-3p，可通过靶向结合刺激蛋白1基因(SP1)来抑制其下游G1/S-特异性周期蛋白-D1基因(CCND1)和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)基因的表达，抑制肝癌细胞(HCC)增殖并诱导细胞凋亡[23]；miR-22-3p通过调控Onecut 1(OC1)/血管内皮生长因子A (VEGFA)信号通路抑制内皮祖细胞增殖和迁移[24]。本次研究结果表明，miR-22-3p可抑制小鼠成肌细胞增殖，提示miR-22-3p可在多种细胞类型中抑制细胞增殖过程，为今后miR-22-3p的生物学功能研究提供了理论参考。

miR-22-5p被认为是心血管疾病和癌症的候选生物标志物。研究发现，在急性心肌梗死患者的血浆中，miR-22-5p的表达发生了显著变化，被认为是急性心肌梗死的潜在生物标志物[25-27]；miR-22-5p上调可抑制棒状体相关蛋白1癌基因家族成员/细胞外调节蛋白激酶(RAP1/ERK)信号通路，从而保护心肌[28]。本研究结果表明，miR-22-5p可在成肌细胞增殖的过程中起到负调节作用，该结果对于miR-22-5p的生物学功能研究是一个重要的补充，同时为骨骼肌生长发育的miRNA调控机制提供了新的见解。但是，miR-22-3p/5p抑制成肌细胞增殖的具体调控机制尚不明确，需要通过更全面的体外或体内试验进一步研究。

本研究结果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p可不同程度的抑制小鼠成肌细胞的增殖，丰富了miR-22的生物学功能认知，为今后动物肌肉发育的分子育种研究提供了理论基础。