中药复方对大鼠后肢关节炎模型的疗效及相关机理研究

高娇阳，姜 聪，刘 宏，张宏伟，李 佳

(北京农学院 动物科技学院；兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

关节炎与自身免疫反应、感染、代谢紊乱、创伤、退行性病变等因素相关,病因多样且发病机制复杂。目前少有研究能将其发病机制完全阐明，因此临床上还未有特异性治疗药物[1]。常规西医治疗方法副作用较大，且难以完全治愈，所以在人医临床上常应用中医药对患者进行治疗且疗效显著[2]。目前宠物临床中犬后肢关节炎发病率较高，尚无特效药物，而应用传统复方中药进行动物后肢关节炎疾病的治疗鲜有报道。关节炎在传统中医理论中为“痹症”中的一种，在经典古方中，独活寄生汤、定痛散及七厘散可用于“痹症”的治疗，因此本研究旨在探讨独活寄生汤、定痛散及七厘散对后肢关节炎的治疗效果，以期为宠物临床中应用传统经典中药复方治疗动物后肢关节炎疾病积累资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组及给药

SD大鼠50只，雌雄各半，体重188～212 g，分笼饲养，室温25 ℃，相对湿度40 %～60 %。适应性饲养7 d后，随机分为对照组、模型组、3种复方中药治疗组(独活寄生汤组、定痛散组、七厘散组)，每组10只。除对照组外，对其余4组大鼠进行造模，造模成功后，3种复方中药治疗组每组分别给予10 g/kg大鼠体重的生药灌胃，每日1次。对照组、模型组同时给予10 g/kg体重生理盐水灌胃，每日1次。连续给药14 d。

1.2 主要仪器及试剂

II 型胶原蛋白酶，美国Sigma；大鼠TNF-α ELISA Kit，日本TaKaRa；大鼠IL-1β ELISA Kit，日本TaKaRa。旋转蒸发仪R501，上海申顺生物科技公司；全自动高压灭菌器；真空干燥箱DZF6090型，上海一恒科技有限公司；超纯水仪，日本Millipol；LBY-BX红细胞变形仪，北京普利生仪器有限公司；LBY-N6B 全自动自清洗血流变仪，北京普利生仪器有限公司；LBY2 F200B微量血浆黏度计，北京普利生仪器有限公司；激光散斑血流系统，Perimed AB。

1.3 试验方法

1.3.1 大鼠后肢关节炎模型的建立

将II型胶原蛋白与无菌生理盐水充分混匀，制成0.2 mg/mL乳剂注射，按0.1 mL/只大鼠剂量，注射于大鼠关节腔[3]。对照组大鼠于相同部位注射等量生理盐水。同时，为了造成血瘀证导致慢性关节炎的效果，使用冰水浴浸泡大鼠双后肢，每天1次，每次10 min，连续3周。造模成功的判定标准为大鼠后肢膝关节肿胀，伸直和屈曲的活动角度和对照组相比显著降低，血液流变学指标及血流灌注量指标和对照组相比有显著差异。

1.3.2 中药复方生药的制备 独活寄生汤组方：独活9 g、桑寄生、细辛、秦艽、防风、肉桂、牛膝、杜仲、熟地、当归、川芎、白芍、党参、茯苓、甘草各6 g；定痛散组方：天花粉500 g(炒)、甘草75 g(炒)、没药、木香各30 g，乳香45 g、陈皮75 g、当归45 g、血竭45 g、大附子10 g；七厘散组方：血竭500 g、乳香(制)75 g、没药(制)75 g、 红花75 g、儿茶120 g、冰片6 g、麝香6 g、朱砂60 g。采用水提醇沉法制备生药，中药饮片加凉水浸泡1 h，使水面高出饮片2～3 cm，大火煮沸后，再用文火煮30 min，每剂煎3次。将3次药液合并，使用旋转蒸发仪减压蒸馏，浓缩生药药液至1 g/mL备用[4,5]。

1.3.3 关节炎屈曲度相关指标的检测 膝关节活动范围的检测：处死前测量大鼠膝关节活动范围。用测量仪测量其完全伸直到弯曲的角度，即关节活动最大值。每只大鼠重复测量3次，取平均值作为最终测量值。关节炎指数的检测：观察关节肿胀程度并采用4分制记分，无关节肿胀为0分，关节轻度发红、肿胀为1分，关节重度发红、肿胀为2分；膝关节及整个趾端严重发红、肿胀为3分；严重肿胀且不能负重为4分[6]。四肢积分累积为AI值，最高为16分[7]。

1.3.4 血流灌注量及血液流变学指标的检测 采用速眠新麻醉大鼠，固定其头部及四肢，暴露颈部以下被毛。使用激光散斑血流监测视频系统检测大鼠血流灌注量变化。检测部位为3 mm2的肿胀部位区域及背部区域(基本覆盖小鼠背部)，在背部区域中划定约40 mm2的圆形区域，固定激光探头到皮肤距离为20 cm，连续检测15 min。计算第10 min至15 min平稳状态下，该区域的平均血流灌注量。采用快速心脏采血，在2 h内检测血样的全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集及变形指数。

1.3.5 外周血及关节液中相关炎性因子的检测 用ELISA法测定大鼠外周血及关节液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的水平，严格按照试剂盒说明书操作。

使用SPSS16. 0软件对数据进行单因素方差分析，表现形式为平均数±标准差(Mean±SD)。

2 结果与分析

2.1 3种复方中药对模型大鼠关节炎指数和膝关节伸直与屈曲角度的影响

如表1结果显示，模型组与对照组比较，关节炎指数极显著增加(P<0.01)，伸直角度极显著降低(P<0.01)，屈曲角度极显著增加(P<0.01)；与模型组比较，独活寄生汤组关节炎指数极显著降低(P<0.01)，伸直角度显著增加(P<0.05)；七厘散组关节炎指数显著降低(P<0.05)，伸直度显著增加(P>0.05)，屈曲度显著降低(P<0.05)；定痛散组关节炎指数极显著降低(P<0.01)，伸直角度与屈曲角度变化差异不显著。

2.2 3种复方中药对模型大鼠血液流变学指标的影响

如表1结果显示，模型组与对照组比较10S-1全血黏度、60S-1全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数、均极显著升高(P<0.01)，红细胞变形指数显著降低(P<0.01)；独活寄生汤组与模型组比较，10S-1全血黏度、红细胞聚集指数均极显著降低(P<0.01)，红细胞变形指数极显著升高(P<0.01)；定痛散组与模型组比较，10S-1全血黏度、红细胞聚集指数极显著升高(P<0.01)，60S-1全血黏度、150S-1全血黏度显著降低(P<0.05)；红细胞变形指数显著升高(P<0.05)；七厘散组与模型组比较，仅红细胞聚集指数显著下降(P<0.05)。

2.3 3种复方中药对模型大鼠血流灌注量的影响

如表1结果显示，模型组与对照组比较，局部血流灌注量显著降低(P<0.05)，背部血流灌注量极显著降低(P<0.01)。独活寄生汤组与模型组比较，局部血流灌注量极显著增加(P<0.01)，背部血流灌注量显著升高(P<0.05)；定痛散组与模型组比较，局部血流灌注量变化差异不显著(P>0.05)，背部血流灌注量极显著增加(P<0.01)；七厘散组与模型组比较，局部血流灌注量变化差异不显著(P>0.05)，背部血流灌注量极显著增加(P<0.01)。

2.4 3种复方中药对模型大鼠炎性因子的影响

如表1结果显示，模型组与对照组比较，血清中IL-1β与TNF-ɑ水平及关节液中IL-1β与TNF-ɑ水平均极显著增加(P<0.01)。独活寄生汤组与模型组比较，血清中IL-1β水平显著降低(P<0.05)，TNF-ɑ水平极显著降低(P<0.01)。关节液中IL-1β水平极显著降低(P<0.01)，TNF-ɑ水平显著降低(P<0.05)；定痛散组与模型组比较，血清IL-1β水平、关节液IL-1β水平与关节液TNF-ɑ水平均显著降低(P<0.05)；七厘散组与模型组比较，关节液TNF-ɑ水平显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 大鼠后肢关节炎模型的建立

文献记载中后肢关节炎造模方法主要有手术法、非手术法、自发模型三类[8-10]。十字韧带切开法等手术法需手术操作，恢复期较长且造模后模型动物后肢关节炎损伤程度及稳定性难以统一[11]，自发模型价格昂贵[12]。因此，经过比较选取了非手术法中的胶原蛋白酶注射法进行大鼠后肢关节炎模型的建立。在注射胶原蛋白酶的基础上，采用了冰水浴刺激大鼠，模拟气滞血瘀状态下的慢性关节炎。通过该方法成功建立气滞血瘀型关节炎大鼠模型，并通过观察大鼠关节肿胀程度、关节伸直曲屈角度、血液流变学指标、血流灌注量及炎症因子水平，对造模效果进行评价。结果显示，模型组大鼠后肢关节肿胀明显,膝关节伸直角度极显著减小，屈曲角度极显著增大，膝关节活动范围下降，除150S-1切变率下全血黏度变化不显著，其余不同切变率下全血黏度，血浆黏度，红细胞聚集指数均有增加，红细胞变形指数下降均差异极显著。且局部血流灌注量显著减少，背部血流灌注量极显著减少。以上说明模后大鼠血液循环障碍，血液流通不畅，可认为其血液瘀滞，气血运行不畅，从中医角度判断，符合中医理论中“痹症”致病因素的描述[13]。模型组血清和关节液中炎症因子TNF-α和IL-1β的水平极显著升高(P<0.01)，关节炎症反应明显。因此综合以上结果，说明已成功建立大鼠后肢关节炎模型，可用于后续中药复方治疗效果的研究。

表1 大鼠关节炎相关指标检测结果Tab.1 Results of arthritis related indexes in rats

3.2 3种复方中药对模型大鼠的综合治疗效果观察

研究结果显示，独活寄生汤能够减轻CIA大鼠关节肿胀程度，增加膝关节活动范围，降低其血清与关节液中炎性因子水平，增加血液灌注量，降低血液黏度，促进血液循环，定痛散也能够减轻CIA大鼠关节肿胀程度，增加膝关节活动范围，效果与独活寄生汤相近。在改善血液流变性质方面，定痛散强于独活寄生汤和七厘散。定痛散能够增加血流灌注量，但仅在促进背部血流灌注方面表现优异，其有一定降低炎症因子水平的作用，但效果弱于独活寄生汤，优于七厘散。七厘散在减轻CIA大鼠关节肿胀程度、改善血液循环和降低炎症因子水平方面均有一定效果, 但仅在促进背部血流灌注方面优于独活寄生汤。综合上述各项指标，独活寄生汤在减轻CIA大鼠关节肿胀、促进血液循环、降低炎症因子水平方面均效果较好，其综合治疗效果强于定痛散和七厘散。分析独活寄生汤组方，其中独活、秦艽、防风、细辛为君药能祛风湿、止痹痛。桑寄生配伍杜仲、牛膝能益肝肾、强筋骨、祛风湿为臣药。当归、川芎、白芍、熟地黄养血兼活血，党参、茯苓补气健脾，肉桂温通血脉共为佐药。甘草为使药益气扶正，调和诸药，诸药合用祛除风湿、强筋健骨、养血活血、补气健脾[14]。有现代研究指出，独活寄生汤能够有效改善患者微循环状态，缓解炎症症状，延缓关节炎病症发展[15]，本试验结果与该文献报道相符。

3.3 3种复方中药对模型大鼠的治疗机理分析

3.3.1 血液流变学指标变化及其意义 目前临床多通过血液流变学指标变化反应患者血管及血细胞功能状态，检测血液流变学数据能够更全面的了解中药复方的作用效果[16]。本研究结果显示，独活寄生汤组10S-1全血黏度、红细胞聚集指数均极显著降低，红细胞变形指数极显著升高。定痛散组10S-1全血黏度、红细胞聚集指数极显著降低，60S-1全血黏度、150S-1全血黏度显著降低，红细胞变形指数显著升高。该结果说明，经过独活寄生汤和定痛散给药后，CIA大鼠的血液粘稠程度降低，流动性增强，红细胞的状态和活性得到改善，从而使大鼠的血液流变学指标趋于正常，且定痛散对于血液流变学指标的改善效果强于独活寄生汤。七厘散对血液流变学各项指标的作用效果有限。该结果说明独活寄生汤和定痛散可降低CIA大鼠的血液粘稠度、改善血流速度和红细胞状态，从而达到对CIA大鼠行气活血的治疗效果，与文献中指出独活寄生汤对血液流变学有着明显的改善作用的报道相符[16,17]。

3.3.2 微循环指标变化及其意义 微循环对维持组织和器官的生理功能起重要作用，文献报道证明关节炎与微循环障碍有关，血流灌注量指标在很大程度上可反应动物机体微循环的状态[18]。独活寄生汤组与模型组比较，局部血流灌注量极显著升高，背部血流灌注量显著升高，说明独活寄生汤对于促进血液循环的作用效果明显，使局部与背部的血流灌注量均得到改善。定痛散组和七厘散组对局部血流灌注量的作用效果不显著，仅使背部血流灌注量极显著增加，说明定痛散与七厘散均有一定促进血液循环的作用，但对病变局部的作用效果有限。该结果说明独活寄生汤对CIA大鼠发挥较好的治疗作用与其能够提高大鼠的血流灌注量从而改善大鼠微循环状态，达到活血化瘀的治疗效果有关，与相关文献报道相符[19]。

3.3.3 炎性指标变化及其意义 IL-1β、TNF-ɑ是关节炎症中的关键炎症介质。独活寄生汤组大鼠血清IL-1β水平、关节液TNF-ɑ水平显著降低，血清TNF-ɑ水平、关节液IL-1β水平极显著降低。该结果说明独活寄生汤可降低CIA大鼠机体内炎症因子的水平，从而减轻炎症反应，对大鼠关节炎发挥治疗作用。定痛散组大鼠血清IL-1β水平、关节液IL-1β水平与关节液TNF-ɑ水平均显著降低，该结果说明定痛散对于CIA大鼠也具有一定的抗炎治疗效果，但其抗大鼠关节炎的效果弱于独活寄生汤。七厘散组大鼠仅关节液TNF-ɑ水平显著降低，其他各项指标未见显著差异，说明七厘散对CIA大鼠发挥抗炎效果有限，其抗炎效果弱于独活寄生汤和定痛散。有文献报道中指出，独活寄生汤可有效降低动物机体炎症因子水平，达到抗炎抗风湿的效果[20]。本试验结果与该文献报道相符，且其抗炎效果的发挥与其降低大鼠关节液中炎症因子水平有关。

综上所述，3种复方中药对CIA大鼠均显示出一定治疗效果，其中独活寄生汤效果最佳，定痛散次之，其机理与降低炎性因子的水平、降低血液粘稠度以及改善微循环的活血化瘀作用有关。该结果说明应用传统中药复方治疗关节炎有潜在的临床价值。