高黎贡山几株绿僵菌菌株的耐逆性测定

陈自宏 陈 凯 谢琪敏

（1.保山学院 高黎贡山生物资源研究所；2.云南省高校滇西昆虫资源保护与利用重点实验室，云南 保山 678000）

绿僵菌（Metarhizium）一种在生防上应用较广泛的昆虫病原真菌[1]。绿僵菌生物制剂具有致病力强、易生产、持效期长、应用效果好、安全性好等优点，具有广阔的应用前景[2,3]。

利用绿僵菌来防治农林害虫的研究与实践已逾百年[4]，近年来对绿僵菌生防研究的报道较多[2,5]，但很多都是室内毒力测定效果很好，室外推广应用效果却受到自然环境因素的限制，故其真菌制剂的商品化进展十分缓慢[6]。昆虫病原真菌在实际应用过程中，田间自然环境因素难于人为控制，多种环境胁迫因子可影响真菌孢子萌发和菌丝生长，从而降低其杀虫毒力[7,8]。绿僵菌对逆境因素的耐受能力在种间、种内，甚至不同菌株间都存在较大差异[9]。绿僵菌菌剂研发中应选用耐逆性能优良的菌株，增加其生防制剂的防效稳定性。

本研究通过测定来自高黎贡山的不同绿僵菌菌株的耐逆性，筛选耐逆性好的优良菌株，为绿僵菌的田间应用提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：来自高黎贡山的绿僵菌菌株：BUM 2（海拔3 300 m）、BUM 2360（海拔2 360 m）、BUM 2600（海拔2 600 m）、BUM 225（海拔800 m）、BUM 66.1（海拔1 700 m），保存于保山学院真菌实验室。

1.2 耐盐性测定

将PPDA固体培养基配制成3个NaCl浓度梯度（0、0.3、0.6 mol/L），各菌株制备106个/mL的孢子悬液，分别取5 μL涂布接种于不同盐浓度培养基上，于25℃培养。设3次重复。

1.3 耐酸碱性测定

将PPDA固体培养基的pH值配制为3个梯度（5、7、10），各菌株制备106个/mL的孢子悬液，分别取5 μL涂布接种在不同pH梯度的培养基上，于25℃培养。设3次重复。

1.4 高温耐受性测定

参考马丽娟等[10]的方法，各菌株的孢子悬浮液（106个/mL）分别取1.5 mL至2.0 mL的离心管中，分别置于35℃和45℃的恒温水浴锅内水浴，处理时间为3 h，然后分别取5 uL涂布于PPDA培养基上。对照不进行水浴。25℃培养。设3次重复。

1.5 紫外线耐受性测定

取各菌株的孢子悬浮液（106个/mL）1.5 mL至2.0 mL的离心管中，置于紫外灯管（30 W）下40 cm处，照射时间分别为30 min、60 min。对照不进行紫外照射（即处理时间为0 min）。分别取5 μL涂布于PPDA平板上，25℃培养。设3次重复。

1.6 产孢量测定

各处理培养相同时间后（8～10 d），刮下孢子粉后，用体积分数为0.1%的吐温-80无菌水将分生孢子制成悬浮液，并加入3-5粒玻璃珠，振荡均匀后，显微镜下用血球板计数，并计算各菌株的产孢量。

2 结果与分析

2.1 不同盐浓度对绿僵菌菌株产孢量的影响

用不同盐浓度的培养基来培养绿僵菌菌株，结果（表1）显示，不同盐浓度处理下各菌株的产孢量差异很大。盐浓度从零增加为0.3 mol/L时，各菌株的产孢量变化不大，有的菌株产孢量略有提高（BUM 2360、BUM 225、BUM 2600），有的略有下降（BUM 2、BUM 66.1）；而盐浓度继续增加到0.6 mol/L时，各菌株的产孢量都显著降低，说明高浓度盐处理对绿僵菌菌株的产孢量有明显的抑制作用。高盐（0.6 mol/L）处理下，菌株BUM 225的产孢量最高（7.60×106），其次为BUM 66.1（5.43×106）；其它3个菌株的产孢量都下降到较低水平（菌株BUM 2360为2.10×106，菌株BUM 2600为1.63×106，菌株BUM 2为1.13×106）。综上所述，在高盐胁迫条件下，菌株BUM 225的产孢能力最优，其次为菌株BUM 66.1。

表1 不同盐浓度处理下各菌株的产孢量（个/mL）

2.2 不同pH值对绿僵菌菌株产孢量的影响

用不同pH值的培养基来培养绿僵菌菌株，结果（表2）显示，pH值对各菌株的产孢量影响很大。相对于中性培养基（pH=7），酸性（pH=5）和碱性培养基（pH=10）中各菌株的产孢量都显著降低，尤其是高pH（10）条件下各菌株的产孢量降低幅度较大。菌株BUM 66.1和BUM 225在各pH条件下产孢量都显著高于其它菌株。这2个菌株在pH=5的培养基中产孢量仍能维持在较高的水平，BUM 225的产孢量（14.38×106）略高于BUM 66.1（13.60×106）；但在pH=10的培养基中，这2个菌株与其它菌株一样，产孢量降低幅度很大（分别为3.56×106和3.12×106），说明它们对高pH的耐受性也较差，而对弱酸性条件（pH=5）有相对较好的耐受性，以BUM 225的耐受性能最好。

表2 不同酸碱性培养基中各菌株的产孢量（个/mL）

2.2 不同温度对绿僵菌菌株产孢量的影响

在不同温度下水浴处理绿僵菌菌株后正常培养至产孢，结果（表3）显示，随着处理温度增加，绿僵菌菌株的产孢量有降低的趋势，但不同菌株产孢量降低的程度不同。35℃处理后，菌株BUM 2360、BUM 66.1、BUM 225和BUM 2600的产孢量都显著降低，而菌株BUM 2的产孢量变化不显著；45℃处理后，所有菌株的产孢量都有显著降低。35℃和45℃高温处理后，菌株BUM 66.1的产孢量都为最高（分别为1.43×106和1.25×106），说明在高温胁迫条件下，此菌株的产孢量最优；其次为BUM 225（分别为1.21×106和1.05×106）和BUM 2（分别为1.20×106和1.01×106）。

表3 不同酸碱性培养基中各菌株的产孢量（个/mL）

2.1 紫外线不同照射时长对绿僵菌菌株产孢量的影响

绿僵菌菌株在紫外线（UV）下照射不同时长后培养至产孢，结果（表4）显示，UV处理后各菌株的产孢量都有不同程度的下降趋势。与对照（处理0 min）相比，UV照射30 min，BUM 2360、BUM 225和BUM 2600的产孢量都显著降低，而BUM 2和BUM 66.1的产孢量下降程度不显著。UV照射60 min，BUM 2360和BUM 2600的产孢量进一步显著下降；BUM 2、BUM 66.1和BUM 225与照射30 min相比变化不显著，但与对照相比还是显著降低。UV不同处理时长下，菌株BUM 66.1的产孢量都处于最高水平，说明在紫外线胁迫条件下，此菌株的产孢量为最优，其次为BUM 225。

表4 紫外线处理后各菌株的产孢量（个/mL）

3 结论与讨论

作为生物杀虫制剂，绿僵菌具有很多优点，但野外环境因素巨大地限制了其实际应用。加强菌株抗逆特性研究对绿僵菌的生产应用具有重要的作用，筛选抗逆性能好的菌株可提高其菌剂的环境适应性[6]。环境温度和湿度是影响真菌杀虫剂效果的主要因素[6,11]，紫外线照射也可降低绿僵菌分生孢子的活孢率，导致菌株的毒力下降[7]。对于地下害虫的生物防治，土壤的酸碱度也会影响真菌的生活力和毒力。

本研究测定了来自高黎贡山的5株绿僵菌菌株对高盐、高温、酸碱性和紫外线辐射的耐逆性能，筛选到对几种逆境条件具有较高耐受能力的2株绿僵菌菌株。菌株BUM 66.1在高温胁迫和紫外线辐射条件下产孢能力为最优；菌株BUM 225在高盐（0.6 mol/L）和酸性条件（pH=5）下的产孢能力最优；这2个菌株在高pH（10）条件下的产孢量降低幅度都很大，说明它们都不耐受高碱性条件。这2个菌株具有较大的实际应用潜力。

高黎贡山不同海拔地理条件差异大、生态环境复杂多样[12]，其中蕴藏着多样性的绿僵菌物种和大量的绿僵菌菌株资源[13]，可能存在很多耐逆或杀虫性能高的优良菌株。在以后的研究过程中，进一步扩大高黎贡山绿僵菌菌株耐逆性的测定范围，可能会获得更多的耐逆优良菌株。