miR-17-92启动子区基因多态性与子宫内膜癌易感性及预后的相关性*

接智慧，周 岩，吴慧丽，郑莉莉，李 萍，高 翔

(山东第一医科大学第二附属医院妇产科，泰安 271000)

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是全球范围内第二常见女性生殖系统恶性肿瘤，也是导致妇科癌症相关死亡的第三常见原因，其发病呈年轻化趋势[1]。目前EC治疗上存在较多限制，患者难以达到治愈效果[2]。探索EC的发病机制、寻找早诊早治的潜在靶点，对于改善EC患者的预后极其重要。近年来，miRNA与肿瘤的关系是肿瘤学研究的热点之一，其中最具有代表性的是miR-17-92基因簇，其由6种成熟的miRNA组成，研究已发现miR-17-92在多种恶性肿瘤中均异常表达[3]。本课题组前期研究发现，miR-17-92在子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞系及EC组织中存在异常高表达，并与EC的临床病理特征相关[4-5]，但其异常表达的调控机制不清。基因启动子区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可影响基因的表达，SNP位点也是肿瘤易感性研究的优先选择对象[6]。既往研究表明，存在于miR-17-92基因启动子区上的功能性单核苷酸多态性可能通过改变其表达，从而影响多种疾病的发生与预后[7-10]。目前，miR-17-92启动子区基因多态性与EC易感性及预后的关系尚不明确。本研究通过检测EC患者外周血DNA中miR-17-92启动子区rs1813389A/G、rs9515692C/T的基因型，分析探讨其与EC易感性及预后的关系，为EC高危人群的筛选和早期诊断提供新的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2004年4月至2019年4月在山东第一医科大学附属第二医院行手术治疗的398例EC患者为病例组。纳入标准：(1)病理确诊为EC；(2)术前未行放化疗及内分泌治疗。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤病史；(2)合并免疫系统疾病；(3)合并全身感染。按国际妇产科联盟(FIGO)分期标准:早期(Ⅰ～Ⅱ期)294例(73.9%)，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)104例(26.1%)。组织学分类:I型312例(78.4%)、Ⅱ型86例(21.6%)。选取同期于我院健康体检、妇科手术探查证实为良性疾病或由于子宫良性疾病行子宫切除的420例妇女为对照组。本研究经医院伦理委员会批准，患者均取得知情同意并签署知情同意书。病例组及对照组人群的一般特征见表1。

表1 研究人群的一般特征

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集病例组(术前)和对照组妇女静脉血5mL，加入内置有0.85mL枸橼酸钠的试管中，于4℃冰箱保存备用，1周内用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法[11]提取基因组DNA，-20℃冰箱保存。

1.2.2 rs1813389、rs9515692基因多态性检测 采用聚合酶链反应-连接酶反应(PCR-LDR)技术检测所有研究对象rs1813389、rs9515692多态位点的基因型和等位基因频率的分布，由上海捷瑞生物工程有限公司完成(http://www.generay.com.cn)。引物序列：rs1813389上游为5'-CCAGGGTAAGGCTCCATACAT-3'，下游为5'-AAAGCTTTTCTGACACTTTGAGTAGT-3'；rs9515692上游为5'-GGAAACAACCTGGAGGCTCTTCAA3'，下游为5'-TTTCCTCTAACCTGAACCCTGTCT-3',PCR-LDR扩增及两个位点测序结果见图1。

图1 PCR-LDR检测rs1813389、rs9515692位点基因型

1.2.3 随访 189例EC患者随访时间达5年以上，中位随访时间为58个月。采用电话或门诊随访。随访终点事件为患者死亡或随访截止时间(2020年10月)。

1.3 统计学处理 采用SPSS24.0统计软件。采用Hardy-Weinberg平衡检验对rs1813389、rs9515692两个SNP位点基因分型及等位基因频率分布进行检验。病例组与对照组的年龄差异采用t检验，基因型和等位基因频率分布比较采用χ2检验，以非条件logistic回归方法计算表示相对风险度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)。采用Kaplan-Meier法分析rs1813389、rs9515692两个SNP位点不同基因分型患者5年的生存情况，并采用log-rank检验基因分型及等位基因之间的差异，采用Cox风险比例模型分析患者预后生存的相关基因分型及等位基因。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般临床资料 EC组患者的平均年龄(54.1±10.6)岁，对照组为(53.8±9.4)岁，两组妇女的年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。经检验，对照组rs1813389、rs9515692两个位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P=0.297，P=0.086)。表明本研究选取的样本人群有代表性。两个多态性位点基因型频率与EC患者临床特征之间的关系，见表2。

表2 miR-17-92启动子多态性(rs1813389、rs9515692)与EC临床病理学特征的关系[n(%)]

2.2 rs1813389、rs9515692基因多态性与EC发病风险的关系 rs1813389和rs9515692基因型分布见表3。结果表明，与AA基因型相比，携带rs1813389 GG基因型可显著降低EC发病风险(OR=0.49,95%CI=0.32～0.78,P=0.002)；携带G等位基因者EC的发病风险明显低于A等位基因携带者(OR=0.75,95%CI=0.62～0.91,P=0.005)。与CC基因型相比，携带rs9515692 TT基因型可显著降低EC发病风险(OR=0.53,95%CI=0.34～0.82,P=0.004)。携带C等位基因者EC的发病风险明显低于T等位基因携带者(OR=0.77,95%CI=0.63～0.94,P=0.010)。

表3 miR-17-92启动子多态性(rs1813389、rs9515692)与EC发病风险的关系[n(%)]

2.3 rs1813389、rs9515692基因多态性与EC预后的关系 携带rs1813389 AA、AG、GG基因型的EC患者的平均OS分别为36、49、52个月，5年生存率分别为41.6%、70.2%和75%，经Kaplan-Meier分析，AG或GG基因型患者的总生存率明显高于AA基因型患者，差异有统计学意义(P<0.001)；而携带rs9515692基因型CC、CT、TT的EC患者平均OS分别为43、44、48个月，5年生存率分别为60.3%、57.1%、64.0%。经Kaplan-Meier分析，rs9515692C/T多态性与EC患者生存率无关(P=0.812)，结果见图2。进一步校正预后影响因素(年龄、组织学类型、FIGO分级、肌层侵润深度和淋巴结转移)后,经Cox回归多因素分析，结果显示rs1813389 AG或GG基因型是EC患者预后的独立影响因素(HR=0.49,95%CI=0.36～0.82,P=0.007；HR=0.29,95%CI=0.16～0.83,P=0.017)；然而，rs9515692C/T多态性对EC患者的预后无影响。这些结果提示rs1813389 A/G多态性可能在EC预后中起重要作用，结果见表4。

图2 rs1813389、rs9515692不同基因型与EC患者生存的关系(Kaplan-Meier法)

表4 EC患者5年预后的多因素Cox分析

3 讨 论

miRNA-17-92基因簇位于人类染色体13q31-32，C13orf25基因的第3个内含区，可转录形成6种成熟的miRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR20a、miR-19b-1和miR-92a-1)[3]。研究证明,miRNA-17-92在多种恶性肿瘤中过表达，如卵巢癌[11]、弥漫大B细胞淋巴瘤[12]等，被认为与肿瘤的发生发展有关。研究发现，miR-17-92基因簇的成员在EC组织中异常表达[13-14]。前期研究发现,miR-17-92基因簇在子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞系和EC组织中存在异常表达[4-5]。这些研究表明，miR-17-92基因簇与EC的发生发展密切相关，有望成为EC早期诊断和分子治疗的靶点，但miR-17-92基因簇异常表达的机制尚不清楚。

单核苷酸多态性是指在基因组DNA序列中单个核苷酸替换而引起的多态性，是人类可遗传变异中最常见的一种，而启动子区SNP可影响基因的转录，导致与之相关疾病的发生[15-16]。先前研究已证明了miR-17-92启动子多态性与多种疾病易感性之间的联系，Huang等[8]研究发现，miR-17-92基因簇启动子rs9301654多态性可能与中国人群中缺血性脑卒中发病风险降低有关。Wang等[7]报道,rs9515692 CT+TT基因型是系统性红斑狼疮易感性的保护因素。Sun等[9]发现,miR-17-92基因簇启动子的rs9588884和rs982873多态性可降低结直肠癌发病风险，并通过双荧光素酶报告基因实验证实，rs9588884和rs982873两个位点可分别导致miR-20a和miR-17的转录活性降低，而rs1813389与结直肠癌的发病风险无关。这与Huang等[10]在宫颈鳞癌中的研究一致，即rs1813389与宫颈癌的发生也无关。但本研究发现,rs1813389和rs9515692基因多态性可能与降低EC发病风险有关，这一结果与其在结直肠癌和宫颈鳞癌中的研究结果并不一致。原因可能是：(1)rs1813389可能仅与部分类型肿瘤的发病相关；(2)不同研究的样本量不同，如实验样本量不够大，产生Ⅱ型错误的可能性增加，可能导致假阴性的结论。进一步对rs1813389和rs9515692两个位点不同基因型多态性与EC患者的预后进行分析，我们发现携带rs1813389位点不同基因型与EC患者5年生存相关，结果显示携带rs1813389的GG/AG基因型EC患者的OS明显长于AA基因型，可作为EC患者预后的独立影响因素。推测rs1813389和rs9515692可能通过降低miR-17-92家族成员的表达，从而影响EC的发生、发展和预后。因此认为，rs1813389和rs9515692基因多态性可能成为EC早期诊断和预后判断的分子标记物，深入对SNP位点功能研究将有助于证实本研究结果。

综上所述，miR-17-92基因簇启动子区rs1813389、rs9515692多态性可能是中国华北地区妇女子宫内膜癌发病及预后的分子标记物，也进一步证实了miR-17-92基因簇的遗传变异可能成为个体肿瘤研究的候选遗传热点。当然，这一结论还需进一步大样本的人群研究，特别是前瞻性的研究证实。