接触环氧乙烷医务人员尿液中N-乙酰基-S-(2-羟乙基)-L-半胱氨酸水平测定方法研究*

熊晓芸，姜秋霞，杨飞朋

1.江苏省疾病预防控制中心职业病防治所检验科，江苏南京 210028；2.江苏省中医院大外科，江苏南京 210004

环氧乙烷(EO)，又名氧化乙烯，是一种最简单的环醚，在常温下为无色带有刺激性气味的气体，蒸汽压高，30 ℃时可达141 kPa。高蒸汽压特性使得EO作为消毒剂熏蒸消毒时穿透力较强，且不损害灭菌物品，被医疗机构广泛应用于医疗用品诸如绷带、缝线及手术器具等的消毒中。但EO具有致突变性、胎儿毒性和致畸特性，对睾丸功能具有不良影响，并能对体内多个器官系统产生损伤。人体长期少量接触EO可引起神经衰弱综合征和植物神经功能紊乱。世界卫生组织国际癌症研究机构已将EO列为1类致癌物。消毒后的医疗用品会有一定水平的EO残留，《医疗器械生物学评价第7部分：环氧乙烷灭菌残留量》[1]中规定，短期、长期和持久接触器械EO残留量的平均日剂量不应超过4 mg/d、2 mg/d和0.1 mg/d。我国医护群体近880万人，该群体在日常工作中长期、频繁接触EO消毒后的医疗用品，导致的职业暴露、职业损伤时有报道[2-7]。国内外都制定了EO职业接触限值，《工作场所空气有毒物质测定方法：环氧化合物》[8]中规定了工作场所空气中EO的采集和测定方法，通过个体采样的方式可有效评估医务人员经呼吸道吸入的EO暴露量，未考虑皮肤、黏膜等接触产生的暴露，本研究通过测定EO在尿液中的生物标志物N-乙酰基-S-(2-羟乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)水平以评估该群体实际内暴露水平。已有多项研究报道了尿液中HEMA测定的方法[9-11]。本研究参考已报道的方法，根据国内同类实验室现况，优化了尿液中HEMA的测定方法，初步应用于评估接触EO医务人员的职业暴露情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年8月江苏省中医院日常工作中接触、使用EO消毒医疗用品的12名手术室器械护士作为试验组，均为女性，年龄21～33岁；另选取同期未接触EO消毒医疗用品的12名放射科医护志愿者作为对照组，均为女性，年龄23～35岁，两组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂 超高效液相色谱仪(UPLC)(30A，日本岛津公司)，配备三重四极杆质谱(QTRAP 5500，美国AB公司)；Acquity UPLC BEH C18液相色谱柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；Millipore纯水机；SIGMA台式离心机。HEMA标准品(纯度大于98%，美国TRC公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(A.R，南京化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、乙酸(色谱纯，上海Aladdin公司)；流动相用水为去离子水。

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)标准储备液(1 000 μg/mL)：称取10 mg HEMA标准品于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液溶解，定容后-20 ℃冷冻避光保存。(2)标准中间液(100 μg/mL)：取1 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀释，定容后4 ℃冷藏避光保存。(3)0.2%乙酸水溶液：2 mL乙酸用去离子水定容至1 L，用作流动相水相。

1.3.2标本制备 收集两组研究对象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，分别混匀后取出部分尿样分装到5支10 mL标本管中，与剩余尿样一并冷冻保存；测定前取其中1支分装至标本管，室温下解冻，混合均匀后取1.0 mL的尿液，加20 μL的甲酸酸化，12 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜；移取200 μL滤液至棕色进样瓶中，加800 μL 0.2%甲酸水溶液，混匀后待测。

1.3.3仪器条件 (1)色谱条件：流动相为0.2%乙酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脱程序，乙腈的体积分数在0.0～<1.0 min内为5%，1.0～<4.0 min内线性增加至95%，4.0～<5.0 min内维持在95%，5.0～5.5 min内线性减少至5%，平衡至6.0 min结束；流量为0.5 mL/min；柱温箱设定为40 ℃；进样2.0 μL，保留时间为1.74 min。(2)质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子扫描，多反应监测(MRM)模式；将10 μg/mL HEMA标准溶液注入三重四极杆串联质谱仪的一级质谱中并进行扫描，选择确定化合物分子离子峰丰度最大的质谱条件；再在二级质谱中进行子离子扫描，调整优化碰撞能量，在保证子离子分辨率的前提下获得最佳灵敏度；HEMA分子结构中存在羧基，电离方式采取电喷雾离子源质谱；根据色谱条件优化后的保留时间(1.74 min)截取1.0～2.5 min流动相进质谱仪；喷雾电压-4.5 kV；离子源温度540 ℃；雾化气流量8.4 L/min，气帘气流量30.5 L/min，辅助雾化气流量6.8 L/min，锥孔电压为-40 V；母离子m/z为206，子离子m/z分别为75和77(定量离子)，碰撞能量分别为-34 eV和-18 eV。

1.3.4定量方式 分别使用去离子水和空白尿液(经上述标本制备程序处理，HEMA水平小于方法检测限)绘制标准曲线和工作曲线，HEMA在0.1～100.0 μg/mL内，工作曲线的斜率为标准曲线斜率的70%，存在较强的基质效应，确定采用工作曲线法来定量。

1.3.5方法学参数测定 按照《职业卫生标准制定指南第5部分:生物材料中化学物质测定方法》[12]中“测定方法性能指标的试验”相关要求进行方法学参数的确定。线性范围、检出限:用上述空白尿液绘制工作曲线,以定量离子峰面积与HEMA水平作工作曲线。回收率与精密度:用空白尿液加标,添加水平至5.0、20.0、80.0 μg/mL(方法测定范围内低、中、高水平),各做6个平行,经前处理后上机测定。

2 结 果

2.1质量色谱图 在上述色谱、质谱条件下，HEMA峰型良好，保留时间为1.74 min，见图1。

图1 HEMA加标样品质量色谱图

2.2方法学参数测定结果 HEMA的线性范围为在0.1 ～100.0 μg/mL ,相关系数为0.999 1;3倍信噪比计算的方法检出限为0.03 μg/mL,10倍信噪比计算的方法定量限为0.1 μg/mL。当加标水平为5.0、20.0、80.0 μg/mL时，加标回收率为91.6%～94.7%,批内精密度为4.7%～7.2%,连续测定3 d的批间精密度为4.5%～8.1%。

2.3试验组与对照组尿液中HEMA水平比较 对照组尿液中HEMA的水平为(1.44±0.29) μg/g肌酐，试验组尿液中HEMA水平为(2.30±1.45) μg/g肌酐，两组HEMA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 对照组、试验组尿液中HEMA水平比较

3 讨 论

《工作场所有害因素职业接触限值第1部分：化学有害因素》[13]中EO的时间加权平均容许水平(PC-TWA)为2 mg/m3，且提示EO除通过吸入接触外，还可通过皮肤、黏膜和眼睛直接接触，经完整的皮肤吸收而引起全身效应，即使空气中EO的水平≤PC-TWA，劳动者仍有可能通过皮肤接触而引起过量接触。医护人员在日常工作中，皮肤、黏膜会长期、频繁接触消毒后医疗用品残留的EO及其蒸气，现有的测定方法仅关注吸入接触，无法完整评估医护群体的实际暴露水平。现有研究普遍认为，HEMA是EO在尿液中的主要代谢产物，丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯也可以通过代谢产生HEMA，但医护人员一般不会接触[9-11]。本研究将HEMA作为医护人员EO职业暴露的生物标志物，通过测定其在尿液中的水平来评估该群体真实内暴露水平。

健康人24 h尿量为0.8～2.0 L，收集研究对象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，测定其中的HEMA水平，可准确评估其EO内暴露水平；混匀后采取小体积分装方式冷冻保存便于单指标重复测定及多指标测定的开展，避免大体积标本的反复冻融造成待测物损失及标本基质情况的改变。目前主流UPLC配备的色谱柱填料粒径普遍不超过2 μm(本研究所用色谱柱填料粒径为1.7 μm)，分离能力得到极大提升，搭配三重四极杆串联质谱，可有效控制质谱检测的离子抑制现象并降低待测物的检出限，为在样品前处理方式中采取酸化、离心、过滤、稀释后直接上机测定的方法提供了技术支撑，为国内未购置自动固相萃取仪的实验室开展相关检测提供简便、有效的解决方案。以去离子水搭配有机溶剂作为流动相时，HEMA峰型较差；在水相中加入乙酸并逐步提高比例至0.2%时，峰型得到最佳优化；在甲醇、乙腈两种常用有机溶剂作为有机相过程中，使用乙腈与使用甲醇响应值无明显区别，但乙腈因具有较强的洗脱能力，在缩短分析时间的同时能实现基线较好分离。本研究结果显示，试验组与对照组的尿液中HEMA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示两种可能：(1)对照组检出水平反映了人群尿液中HEMA基础水平，试验组EO内暴露水平极低，后续可通过扩大试验组岗位类别及调查范围进一步评估该群体EO内暴露水平；(2)对照组检出水平未能反映人群尿液中HEMA基础水平，对照组对象存在其他行为造成非EO接触导致的HEMA水平升高，除接触丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯等化学物质外，有文献报道吸烟也可导致尿液中HEMA水平升高[14]，后续可通过问卷调查的方式全面了解拟纳入人群是否有可能影响HEMA水平升高的生活方式和相关化学物质的接触可能，确保研究中对照组检出水平能真实反映人群尿液中HEMA基础水平，再通过扩大试验组岗位类别及调查范围等方式保证该群体EO真实内暴露水平得到准确评估。

本研究通过建立简便实用、便于推广的方法测定接触EO医务人员尿液中HEMA水平，初步获得12名接触EO医务人员尿液中的HEMA水平，为准确评估研究群体EO真实内暴露水平提供了可靠的技术方案，暴露水平的准确评估能为卫生健康管理部门的决策提供参考，也为我国医疗机构建设相关防护设施，配备相关防护用品，更好地保护接触EO医护群体健康提供准确数据支撑。

综上所述，通过优化前处理方式、色谱条件、质谱参数及定量方式，本研究所使用方法的线性范围、检出限、回收率与精密度等主要性能指标均满足《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质测定方法》的要求，适用于接触EO医务人员尿液中HEMA水平的测定，所需仪器设备均较常见，便于推广。