lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145在高龄肺腺癌患者癌组织中的表达水平及临床价值

袁 旦，邰 萍

江苏省南京市第一医院检验科，江苏南京 210000

肺癌作为目前发病率最高的一种恶性肿瘤，是造成癌症病死率居高不下的重要原因，且发病率呈逐年上升趋势，大部分发病人群为中老年患者，肺腺癌是非小细胞肺癌的常见类型之一。近年来，微创外科技术在恶性肿瘤的治疗中得到广泛应用和发展，已经成为肺腺癌的重要治疗手段，但患者术后预后评价指标仍需要进一步探索[1]。长链非编码RNA(lncRNA)是一种不具备蛋白质编码功能的RNA，一般由200个以上核苷酸组成。现有研究证实，人体95%左右的RNA是不编码功能蛋白的，但很大一部分lncRNA在基因表达调控中发挥重要作用，其可以作为基因调控的一种上游分子，能够从转录及转录后调控、表观遗传学等方面调节基因表达过程[2]。微小RNA(miRNA)是生物体内广泛存在的一类内源性且高度保守的非编码单链RNA，可以参与生物体细胞的增殖、分化、凋亡、免疫、代谢及炎性反应等重要生理过程[3]。miR-34a是一类具有显著抑癌作用的高度保守miRNA，可通过与相关癌基因结合使得癌细胞周期G1期发生停滞，从而抑制癌细胞的增长并促使其凋亡。miR-145是位于人体5号染色体的另一种miRNA，可通过有效调控下游靶基因表达情况抑制肿瘤细胞增殖、分化，且在乳腺癌、肺癌、肠癌等多种恶性肿瘤中发挥重要作用[4]。本研究通过检测肺腺癌患者癌组织中被转化生长因子β激活的长链非编码RNA(lncRNA-ATB)、miR-34a和miR-145表达水平并探讨其与患者预后之间的关系，以期为临床提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年8月至2016年8月在本院治疗的112例高龄肺腺癌患者为研究对象，患者年龄70～85岁，平均(76.41±2.68)岁，其中男64例，女48例，吸烟和非吸烟患者各55、57例，TNM分期为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者分别为57、50、5例。纳入标准[5]：(1)所有患者经组织病理检查确诊为肺腺癌；(2)患者年龄不低于70周岁；(3)患者未发生淋巴结转移；(4)患者入组前未接受过其他胸部手术或化疗；(5)患者无放疗禁忌证且可以耐受手术。排除标准：(1)心、肝、肾功能严重异常者；(2)术前经过新辅助化疗者；(3)合并有严重感染、凝血功能障碍等疾病者；(4)无法完成随访者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 收集并记录入选患者入院时的年龄、性别、TNM分期、病理分级以及影像学检查等临床资料，并以总生存率(OS)作为肺腺癌患者术后生存情况的评价指标。

1.2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表达水平测定 手术过程中获得所有患者癌组织和癌旁组织，并立刻置于-80 °C液氮中保存；统一取出癌组织和癌旁组织并加入TRIzol试剂(Invitrogen 公司)将细胞完全裂解，并于室温条件下静置5 min，然后加入氯仿200 μL于裂解后细胞中，涡旋20 s后再于室温条件下静置5 min。取静置后样品放入离心机中，在12 000 r/min条件下离心15 min，将上清液转移于EP管中并加入异丙醇0.5 mL，混匀并于室温条件下静置10 min。使用Prime Script RT reagent Kit反转录试剂盒(赛默飞世尔中国公司)将总RNA进行反转录，从肺腺癌组织或癌旁组织中提取总RNA，分别得到模板单链cDNA，以18S rRNA作为内参，使用PCR试剂盒(北京康为世纪公司)对cDNA进行PCR。18S rRNA上、下游引物分别为5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′、5′-GGACATCTAAGG GCATCACA-3′。lncRNA-ATB的上、下游引物分别为5′-TGACAAAGGCAG-GAGGTA-3′、5′-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3′。miR-34a qRT-PCR扩增以U6作为对照基因，miR-34a上下游引物分别为5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3′、5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6基因上下游引物分别为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-145 qRT-PCR扩增也以U6作为对照基因，上、下游引物分别为 5′-TCGGTCCAGTTTTCCCAG-3′、5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6基因上、下游引物分别为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′、5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145、U6引物均由金斯瑞生物有限公司合成。最后采用2-ΔΔct计算组织中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145相对表达量(RQ)，并分别根据lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145的RQ中位值将患者分为高、低表达组各56例。

1.3随访 所有患者随访时间为10～50个月，中位随访时间22.3个月，随访截止时间为2020年1月31日。每3个月随访1次，检查内容包括患者肿瘤标志物、胸部 B 超以及CT，同时每年进行头颅磁共振成像(MRI)以及骨扫描检查。

2 结 果

2.1癌组织及癌旁组织中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表达水平比较 癌组织中lncRNA-ATB表达水平显著高于癌旁组织，miR-34a和miR-145表达水平显著低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织及癌旁组织中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表达水平比较

2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145不同表达水平患者术后生存情况比较 所有患者均顺利完成手术，围术期无死亡病例，截止至随访结束，共有24例患者死亡，所有患者的3年OS为78.57%。其中lncRNA-ATB高表达组死亡16例，3年OS为71.43%，低表达组死亡8例，3年OS为85.71%；miR-34a高表达组死亡5例，3年OS为91.07%，低表达组死亡19例，3年OS为66.07%；miR-145高表达组死亡6例，3年OS为89.29%，低表达组死亡18例，3年OS为67.86%。Log-rank检验显示，各指标高、低表达患者的OS比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1～3。

图1 lncRNA-ATB高、低表达组患者生存曲线图

2.3影响患者预后的单因素和多因素Cox分析 对影响患者预后的因素进行单因素分析，并将差异存在统计学意义的因素作为自变量进行Cox多因素分析，以患者生存情况(赋值：死亡=1，生存=0)为因变量，Cox多因素分析结果显示，肿瘤TNM分期升高、发生淋巴结转移和胸膜侵犯、lncRNA-ATB高表达以及miR-34a、miR-145低表达是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

图2 miR-34a高、低表达组患者生存曲线图

图3 miR-145高、低表达组患者生存曲线图

表2 预后影响因素的单因素和多因素Cox回归分析

续表2 预后影响因素的单因素和多因素Cox回归分析

3 讨 论

肺癌的发病率和病死率在众多恶性肿瘤中居首位，且在肺癌的发生发展过程中常伴随多种调控因子的作用，故研究多种调控因子在肺癌患者中的表达水平差异，探讨其对疾病发展机制和预后的影响具有重要的临床意义。lncRNA作为一种长度为200个核苷酸以上的非编码RNA分子，其一级结构类似于核苷酸排列顺序，以往研究误认为lncRNA属于基因的“转录噪音”[6]。随着研究深入，发现lncRNA占哺乳动物基因组序列中转录本的10%左右，相较于产生的1%编码蛋白转录本更多，甚至具有较强的细胞或者组织特异性[7]。研究证实，lncRNA不仅直接调控靶基因转录以及翻译过程，还可间接调控靶基因的上下游基因，其在基因重组、细胞周期调控、蛋白质转录和翻译等多种生理过程中发挥重要的作用，与机体细胞生长、分化、凋亡等重要过程以及一些恶性肿瘤关系密切，为肺癌等恶性肿瘤的发生机制研究提供了重要方向[8]。lncRNA-ATB作为一种新发现的lncRNA，许多研究均证实其在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要的调控作用，且与患者预后显著相关[9-12]。丁如良等[9]研究结果显示，结直肠癌患者的癌组织和血清中lncRNA-ATB过度表达，且患者的病灶大小、是否发生淋巴结转移以及胸膜侵犯都会影响lncRNA-ATB的表达水平。预后研究显示lncRNA-ATB呈过度表达的患者预后更差，中位生存期更短[10]。本研究结果显示，肺腺癌患者癌组织lncRNA-ATB表达水平高于癌旁组织，与上述研究结论一致，提示lncRNA-ATB在肺腺癌等恶性肿瘤的发生发展过程中扮演癌基因角色。多因素分析显示，除肿瘤TNM分期、是否发生淋巴结转移和胸膜侵犯外，lncRNA-ATB表达水平也与患者预后有关。推测lncRNA-ATB表达水平可能与肺腺癌恶性程度以及转移情况存在密切联系，提示lncRNA-ATB可能在肺腺癌的病情进展中发挥重要作用。WANG等[11]研究结果证实，lncRNA-ATB参与了恶性肿瘤侵袭转移级联反应，并对该过程具有一定促进作用。SONG等[12]研究发现，lncRNA-ATB能够通过上调E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)和锌指蛋白(ZNF)-217的表达水平以诱导上皮-间质转化，从而进一步促进乳腺癌的侵袭和转移，故推测lncRNA-ATB可能是通过上述途径促进肺腺癌的扩散和转移，从而影响患者术后生存情况，与本研究结果相符。

随着人们对miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制的深入了解，miRNA在恶性肿瘤治疗中的重要作用逐渐被揭示，不仅可以将其作为恶性肿瘤早期诊断和预后预测的一种生物标志物，miRNA还有望成为治疗肿瘤的一种新型药物。miRNA是一种由20～25个核苷酸组成的人体内源性非编码小分子RNA，可参与调节胚胎发育、细胞分化凋亡等多种生物学过程。其可以与靶基因信使RNA(mRNA)之间发生相互作用，抑制转录后翻译过程，从而对靶基因产生负性调控并降低相关蛋白表达量。miRNA对于恶性肿瘤的发生发展具有重要作用，扮演着癌基因或抑癌基因的角色[13]。miR-34a和miR-145能影响细胞周期以及染色体结构形成，已有研究证实，miR-34a和miR-145可以抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖[14]。彭淑贤等[15]研究结果发现，肺腺癌患者癌组织中miR-34a表达水平显著低于癌旁组织和正常组织，且在癌组织、癌旁组织、正常组织中呈依次升高趋势；王瑞娟[16]研究结果显示，肺腺癌组织中miR-145异常低表达，且随着肿瘤病理分级越高、肿瘤细胞转移程度越高，患者的miR-145表达水平越低。说明miR-34a和miR-145表达水平可以作为肺腺癌患者病情严重程度的监测指标。本研究结果显示，肺腺癌组织miR-34a和miR-145表达水平低于癌旁组织，且miR-34a、miR-145低表达与患者预后相关，提示miR-34a、miR-145可能均属于抑癌基因。段亚男等[17]研究证实miR-145可以靶向调控结缔组织生长因子(CTGF)表达水平以发挥肺腺癌病情调控作用，CTGF是由多种细胞分泌合成的具有参与和调控细胞有丝分裂、增殖以及黏附过程的细胞因子，同时CTGF能够影响新生血管生成以及肿瘤发生发展过程，其在肝癌等多种恶性肿瘤中呈显著低表达。因此，可以将血清miR-145作为恶性肿瘤侵袭潜能以及预后预测的重要生物学指标。许晶晶等[18]报道miR-34a的目的调控mRNA是c-myc蛋白，c-myc是一种可以有效促进细胞进入DNA合成期以快速完成DNA合成与复制的特殊蛋白，因此可以将c-myc的高度表达作为肿瘤发生或发展的重要信息。而人体正常组织和细胞中的miR-34a能与c-myc特异性结合导致c-myc蛋白表达降低，产生明显抑癌作用。

综上所述，lncRNA-ATB在高龄肺腺癌患者癌组织中呈高表达，miR-34a、 miR-145在高龄肺腺癌患者癌组织中呈低表达，且lncRNA-ATB高表达，miR-34a、miR-145低表达是影响患者预后的独立危险因素。