甲状腺乳头状癌组织中E-cadherin、ZEB1表达水平与临床病理特征和预后的关系

付 静，张 晏，刘安楠，杨书文，曹素艳，孙 雪，方 静

北京医院/国家老年医学中心特需医疗部，北京 100730

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌(PTC)是其中最常见的亚型，占所有甲状腺癌的30%[1]。PTC预后较好，但也可侵袭淋巴系统、血液系统，约40%的PTC患者可能出现同侧区域淋巴结转移[2-3]。目前的治疗方法包括外科甲状腺切除术，放射性碘(RAI)消融治疗等[4]。钙黏着蛋白(钙依赖性细胞黏附分子)参与维持组织上皮结构，对胚胎发育和正常组织结构的维持具有重要作用[5-6]。E-钙黏着蛋白(E-cadherin)是一种黏附分子，通常在多类癌症(如乳腺癌和结肠直肠癌)中过表达，并被认为是上皮-间质转化(EMT)的诱导剂，在癌症侵袭和转移的早期阶段起重要作用[7]。锌指结合蛋白1(ZEB1)是一种含锌指的转录因子，可以下调E-cadherin的表达并上调N-钙黏着蛋白的表达，这与癌症的发生、发展有关[8]。最近的研究报道，通过抑制E-cadherin转录表达，ZEB1可以触发EMT进程，使上皮细胞从原始位置迁移并形成中胚层和神经原位癌组织，这与肿瘤侵袭性进展有关[9]。本研究拟探讨PTC组织中E-cadherin、ZEB1表达水平与临床病理特征和预后的关系，为PTC的诊断及治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2014年6月至2017年9月收治的68例PTC患者作为研究对象，其中男30例，女38例，平均年龄(59.33±15.36)岁，平均体质量指数(BMI)为(24.69±3.25)kg/m2。所有患者经超声检查及细胞学病理检查确诊，均在本院接受了PTC切除术，且均未接受术前化疗。取PTC患者癌组织为病例组，同时取癌旁正常组织(距癌组织5 cm以上)为对照组。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床病理特征收集 收集研究对象的临床病理特征，包括年龄、肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、肿瘤复发情况。

1.2.2E-cadherin、ZEB1 mRNA表达水平检测 使用Trizol试剂(美国Life Technologies公司)提取总RNA。为定量E-cadherin、ZEB1水平，使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)进行逆转录，并使用TaqMan miRNA分析(美国Applied Biosystems公司)来测量E-cadherin、ZEB1的表达。使用U6小核RNA作为内部对照。通过SYBR绿色PCR测定法(美国Qiagen公司)检测E-cadherin、ZEB1 mRNA的表达水平。引物序列如下：E-cadherin，正向，5′-GGGAGATCAGAAGGTGA TT-3′；反向，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6正向，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。ZEB1，正向，5′-AGCAGCAAGAAGAACAAACAAGGG-3′；反向，5′-AGTGACTAATGGCTCTGTGATGGC-3′。GAPDH，正向，5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTTG-3′；反向，5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。荧光定量PCR条件：50 ℃ 10 min，92 ℃ 60 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共60个循环。

1.2.3E-cadherin、ZEB1蛋白表达水平检测 免疫组织化学(IHC)：将福尔马林固定和石蜡包埋的标本切片(5 μm厚)用二甲苯脱蜡，并按乙醇100%、95%、70%、50%和30%的降序水化。将载玻片浸入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，然后在微波炉中煮沸10 min，以进行热诱导的抗原修复。将切片用10%的正常山羊血清在室温下封闭，非特异性结合30 min。随后将切片与上述兔抗E-cadherin、ZEB1一抗(1∶200；英国Abcam公司)在4 ℃孵育过夜，随后将玻片与过氧化物酶(HRP)偶联抗兔IgG二抗孵育在室温下放置30 min，最后将切片在室温下使用3,3′-二氨基联苯胺染色10 s至1 min，然后用0.5%苏木精复染，在室温下放置1 s。随后，将载玻片脱水并固定。IHC染色由本院病理科的两名病理医师独立评分。在光学显微镜(德国Carl Zeiss AG公司)下，以200放大倍数在每个样品的5个视野中评估免疫染色。细胞内棕色染色的存在被认为是E-cadherin、ZEB1的阳性染色。代表阳性细胞百分比的得分如下：0分，≤5%；1分，>5%～20%；2分，>20%～50%；3分，>50%。染色强度评分如下：0分，阴性染色；1分，染色力弱；2分，中度染色；3分，染色力强。将两个评分的乘积用作总染色评分。

1.3随访 随访方式为电话及门诊联合随访，内容主要为术后生存状况，随访开始日期为出院日期，结束日期为2019年12月1日。

2 结 果

2.1两组E-cadherin、ZEB1 mRNA表达水平比较 病例组E-cadherin mRNA表达水平低于对照组，ZEB1 mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组ZEB1、E-cadherin mRNA表达水平比较

2.2两组E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况比较 病例组E-cadherin蛋白表达评分、阳性率低于对照组 (P<0.05)；ZEB1蛋白表达评分、阳性率高于对照组(P<0.05)。见表2、图1。

表2 对照组、病例组中E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况比较

2.3不同临床病理特征对E-cadherin、ZEB1蛋白表达的影响 E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况在不同肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、肿瘤复发情况患者之间差异有统计学意义(P<0.05)，且当肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、肿瘤复发时，E-cadherin蛋白表达阳性率越低，ZEB1蛋白表达阳性率越高。而PTC组织E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况在<50岁和≥50岁患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注：A、B为E-cadherin蛋白在对照组、病例组中的表达情况；C、D为ZEB1蛋白在对照组、病例组中的表达情况。

表3 不同临床病理特征对E-cadherin、ZEB1蛋白表达的影响[n(%)]

续表3 不同临床病理特征对E-cadherin、ZEB1蛋白表达的影响[n(%)]

2.4不同E-cadherin、ZEB1蛋白表达水平患者预后比较 与E-cadherin阴性组比较，E-cadherin阳性组3年生存率升高及生存期延长；与ZEB1阳性组比较，ZEB1阴性组3年生存率升高、生存期延长，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同E-cadherin、ZEB1蛋白表达水平患者预后比较

2.5PTC患者预后影响因素分析 将PTC患者的年龄、肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、E-cadherin和ZEB1蛋白表达情况等变量纳入多元Cox逐步回归分析，结果显示年龄≥50岁(HR=1.57，95%CI：1.16～2.13)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(HR=2.07，95%CI：1.26～3.41)为PTC患者预后的独立危险因素(P<0.05)，E-cadherin蛋白阳性(HR=0.54，95%CI：0.34～0.86)和ZEB1蛋白阴性(HR=0.61，95%CI：0.46～0.81)为PTC患者预后的独立保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 PTC患者预后影响因素Cox回归分析

3 讨 论

甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞，由多种恶性表型组成，包括未分化、低分化和高分化的甲状腺癌，高分化甲状腺癌分为两类：滤泡性甲状腺癌和PTC[10]。PTC的典型治疗策略是外科手术辅以术后甲状腺激素抑制治疗和RAI消融治疗，但患者如果对这种治疗模式反应率低，其生存率不高。因此，寻找PTC临床病理特征的敏感标志物对于PTC治疗策略的制订意义重大。

本研究结果显示，病例组E-cadherin mRNA表达、蛋白表达评分、蛋白表达阳性率低于对照组，ZEB1 mRNA表达、蛋白表达评分、蛋白表达阳性率高于对照组，提示PTC组织中E-cadherin表达水平降低、ZEB1表达水平升高。E-cadherin属于钙黏着蛋白家族，其主要成分是单链跨膜糖蛋白。E-cadherin可能与β-连环蛋白(β-catenin)相互作用形成cadherin/catenin复合物，以维持上皮细胞的结构和功能[11-12]。同时，E-cadherin表达的下调也参与了EMT过程以及肿瘤细胞的浸润和转移[13]。

ZEB1在多种类型上皮癌中过表达，包括肝细胞癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等，其表达失调与癌症患者的不良结局有关；通过诱导EMT过程，ZEB1能促进癌细胞的转移，并可能赋予癌细胞抗化学性和干性[14]。对其他癌症的研究还表明，E-cadherin可以通过直接抑制ZEB1的转录来削弱癌细胞之间的黏附特性，从而导致乳腺癌的浸润和转移[15]。本研究结果显示，PTC组织中E-cadherin表达水平降低、ZEB1表达水平升高，与既往研究结果一致。

进一步分析不同临床病理特征对E-cadherin、ZEB1蛋白表达的影响发现，E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况在不同肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、肿瘤复发情况患者之间差异有统计学意义(P<0.05)，且当肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、肿瘤复发时，E-cadherin蛋白阳性表达率越低，ZEB1蛋白阳性表达率越高(P<0.05)，提示ZEB1有促进PTC侵袭、转移的作用，而E-cadherin对PTC则具有抑制作用。多项细胞学研究结果显示，下调ZEB1的表达可逆转耐药性肺癌的EMT过程，使用Ⅰ类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂Mocetinostat干扰ZEB1功能会上调miR-203的水平，诱导癌细胞对化疗敏感[16-17]。同时，由沙利霉素引起的ZEB1表达下调降低了套细胞淋巴瘤细胞对吉西他滨、阿糖胞苷和阿霉素的细胞毒性作用的抵抗力[18]。这些证据表明ZEB1具有促癌作用。E-cadherin调节癌细胞的侵袭和转移，并已被确定为多种类型肿瘤的非侵袭性生物标志物[19]。在肺癌患者中测得E-cadherin水平明显降低，E-cadherin的失调可能对肺癌的诊断很有价值[20]。此外，E-cadherin能促进肝癌细胞的生长和迁移，较高水平的E-cadherin与肝癌的侵袭性有关。既往研究表明，E-cadherin能靶向作用于某些致癌基因或肿瘤抑制因子，例如E-cadherin通过调节激活转录因子2抑制肺癌的发展，通过调节雌激素受体α和自噬增加乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性，与本研究结果一致[21-22]。PTC患者预后因素分析显示，E-cadherin阳性组、ZEB1阴性组3年生存率升高、生存期延长，说明E-cadherin蛋白表达阳性，ZEB1蛋白表达阴性的PTC患者能获得较好的预后。

综上所述，PTC组织中E-cadherin表达水平降低、ZEB1表达水平升高； PTC的临床病理特征会影响E-cadherin、ZEB1蛋白表达情况；E-cadherin蛋白表达阳性、ZEB1蛋白表达阴性的PTC患者能获得较好的预后。