两种丝状真菌前处理试剂在质谱鉴定中的比较*

彭雨萌，宗来斌，董晓燕，金大智，吕火烊

1.蚌埠医学院研究生院，安徽蚌埠 233030 ；2.浙江大学附属第四医院检验科，浙江义乌 322000 ；3.浙江省中医药大学第二临床医学院，浙江杭州 310053 ；4.杭州医学院检验医学院，浙江杭州 310053 ；5.浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院临床医学检验中心，浙江杭州 310014

近年来，随着器官移植、肿瘤、艾滋病和重症监护室患者的增多，临床免疫抑制剂和激素使用增多以及抗菌药物的滥用，丝状真菌感染的发病率呈上升趋势[1-3]。由于丝状真菌对一些常用的抗真菌药物存在天然耐药，且不同种类的丝状真菌具有不同的耐药谱，因此丝状真菌鉴定到种水平在疾病的诊治中至关重要[4-6]。目前丝状真菌的检测方法以形态学为主，但是丝状真菌培养所需时间较长，且形态学方法易受检验人员主观因素的影响，具有一定的不准确性。血清学检测虽然对真菌病的辅助诊断具有一定的参考意义，但是其灵敏度和特异度较差，在临床诊断中无确诊意义[7-8]。分子生物学检测目前虽然作为丝状真菌检测的金标准，但是因其操作烦琐、需特殊实验室、价格昂贵等原因，目前并未在临床检测中普及[9-10]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术因其简便、快速和准确地鉴定到种水平而得到广泛应用[11-12]。MALDI-TOF MS技术检测丝状真菌步骤包括点靶、前处理和上机，但由于丝状真菌细胞壁较厚，不易被破坏提取蛋白，因此前处理是此方法中的关键步骤。目前用于丝状真菌前处理的试剂有自配试剂和商品化试剂盒，本研究比较自配试剂和VITEK MS 丝状真菌试剂盒在丝状真菌质谱鉴定中的准确率，旨在为临床摸索出最优选择。

1 材料与方法

1.1菌株来源 从2019年1月至2020年3月浙江省人民医院住院患者的痰液、肺泡灌洗液、纤支镜刷取物、胸腔积液、眼分泌物、血液等培养分离出47株丝状真菌。

1.2仪器与试剂 VITEK MS质谱仪(采用VITEK MS V3.0数据库)、VITEK MS-CHCA基质液购自法国生物梅里埃公司，甲酸和乙腈溶液购自上海凌峰化学试剂有限公司，VITEK MS 丝状真菌试剂盒-Ref.415680购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司，沙氏葡萄糖琼脂(SDA)购自杭州滨和微生物试剂有限公司，DNA提取试剂盒购自北京天根生化公司。

1.3分子生物学鉴定 按照DNA提取试剂盒说明书进行核酸提取，将所提取的核酸进行PCR扩增后将PCR产物送至广州金域医学检验中心有限公司进行测序，引物的碱基序列为ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4的碱基序列为 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，测序结果采用BLAST序列分析工具进行分析，获得丝状真菌菌种鉴定结果。当测试结果与数据库中的同源性达到98%时，认为结果可靠，选择同源性最高的结果作为菌种的最终结果。

1.4质谱技术鉴定

1.4.1自配丝状真菌前处理试剂 配制70%甲酸：用蒸馏水和购买的甲酸试剂配制成70%甲酸溶液，甲酸易挥发，每次使用需现配现用。除去VITEK-MS V3.0数据库中没有的菌株，将剩余丝状真菌接种在SDA培养基上，置于28 ℃温箱中培养5 d，取直径0.5 cm菌落置于900 μL 75%乙醇中静置10 min，13 000 r/min离心2 min，弃上清液后静置10 min，加入40 μL 70%甲酸涡漩振荡10 min，再加入乙腈涡漩振荡3 min，13 000 r/min离心2 min。每个标本做3次平行实验。取上清液1 μL置于靶板上，干燥后加入1 μL基质液，干燥后上机鉴定，质控菌株为ATCC8739,数据库采用VITEK MS V3.0版。3次平行实验取可信度最高的结果为最终鉴定结果，与分子生物鉴定结果一致，则认为质谱鉴定结果正确，否则认为不正确。

1.4.2VITEK MS 丝状真菌试剂盒-Ref.415680 除去VITEK-MS V3.0数据库中没有的菌株，将剩余丝状真菌接种在SDA培养基上，置于28 ℃温箱中培养5 d，按照VITEK MS 丝状真菌试剂盒-Ref.415680的操作说明书进行。每个标本做3次平行实验。提取上清液后点靶、上机，结果判读同上。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1分子测序结果 47株丝状真菌包括烟曲霉24株、黄曲霉5株、土曲霉4株、黑曲霉3株、构巢曲霉2株、亮白曲霉2株、聚多曲霉1株、茄病镰刀菌复合群1株、尖端赛多孢1株，裂褶菌1株，海豚镰刀菌1株，小孢头束霉1株，微紫青霉1株。

2.2自配试剂与商品试剂盒质谱鉴定准确率的比较 除去VITEK-MS V3.0数据库中没有的4种菌株(裂褶菌、海豚镰刀菌、小孢头束霉、微紫青霉)，剩余43株。43株丝状真菌进行质谱鉴定，自配试剂质谱鉴定准确率为88.37%，商品化试剂盒质谱鉴定准确率为95.35%，两者准确率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同前处理试剂的质谱鉴定结果比较

2.3分子测序及质谱鉴定菌株结果 43株丝状真菌分子生物学测序以及使用两种不同试剂提取丝状真菌蛋白质谱鉴定结果见表2。

表2 菌株鉴定结果(n)

3 讨 论

MALDI-TOF MS是基于细菌和真菌的蛋白质量而获得不同指纹图来达到鉴别细菌和真菌的目的。该技术近年来被普遍认为是一种简便、快捷、高效、经济、准确的微生物病原学检测方法，对丝状真菌引起的相关感染具有准确鉴定的临床意义[13-16]。丝状真菌细胞壁较厚，不易被破坏，蛋白质提取难度较大，因此前处理在质谱鉴定中至关重要。本研究探讨了自配前处理试剂和商品试剂盒质谱鉴定结果的差异。

目前，MOLDI-TOF MS应用于丝状真菌鉴定在临床微生物检测中并未普及，主要因其缺乏简单、可重复、统一的蛋白质提取程序。不同蛋白质提取方法的质谱鉴定准确率差异较大，本研究采用甲酸乙腈法提取丝状真菌蛋白，应用自配试剂和商品化试剂盒两种不同的试剂提取丝状真菌蛋白，比较两种试剂所提取的丝状真菌蛋白质谱结果是否有差异。实验结果表明，自配试剂提取蛋白质谱鉴定准确率为88.37%，商品化试剂盒提取蛋白质谱鉴定准确率为95.35%，差异无统计学意义。LAU等[17]采用磁珠法提取丝状真菌蛋白，421株丝状真菌通过此法提取蛋白的质谱鉴定准确率为88.9%，笔者认为磁珠法可以提高质谱鉴定准确率，黄艳飞等[18]的研究也发现磁珠法较好，但是磁珠法较甲酸乙腈法更为复杂，且需氧化锆-二氧化硅微珠，较单纯使用甲酸乙腈法昂贵。双甲酸夹心法提取丝状真菌蛋白较甲酸乙腈法简单、省时，苍金荣等[19]使用双甲酸夹心法提取丝状真菌蛋白进行质谱鉴定时，鉴定到种的准确率为71.52%(113/158)，但是也有得到高鉴定准确率的报道[20-21]，质谱鉴定准确率不同，可能跟实验所用丝状真菌的菌属不同有关。双甲酸法适用于曲霉属和青霉属等较容易破壁的丝状真菌。CASSAGNE等[22]比较了5种不同丝状真菌质谱鉴定前处理流程，认为甲酸乙腈法最理想。

本研究自配试剂甲酸乙腈未鉴定出的菌株为烟曲霉1株，黄曲霉1株，亮白曲霉2株，茄病镰刀菌复合群1株；商品化试剂盒未鉴定出的菌株为亮白曲霉1株，茄病镰刀菌复合群1株。虽然商品化试剂盒未鉴定出的菌株只有2株，而自配试剂甲酸乙腈未鉴定出5株，但两种试剂相比，差异无统计学意义。自配试剂甲酸乙腈提取丝状真菌蛋白，对于临床常见的丝状真菌准确率可达88.37%(38/43)，对于曲霉中最常见的烟曲霉的准确率可达95.83%(23/24)，可满足临床微生物日常工作的需要。而且两种试剂相比，自配试剂的价格较低，可以在不影响鉴定准确率的情况下，为患者减轻经济负担。

本研究所涉及的菌株以及菌种较少，主要是曲霉属，可能会对实验产生一定的影响，但本研究对临床日常工作的开展仍有一定意义，因为临床最常见丝状真菌感染是曲霉感染[23]。

综上所述，自配试剂和商品化试剂盒两种不同试剂提取丝状真菌蛋白的质谱鉴定准确率比较，差异无统计学意义。自配试剂操作较简单，且可以在不影响质谱鉴定准确率的前提下，提供一种价格更为低廉的检测方法，为患者减轻经济负担。