口腔微生物与结直肠癌相关性的研究进展

郁懿， 章蓓

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的恶性肿瘤之一，其发病率居全球第4位，死亡率居全球第2位[1]。CRC的发生发展与环境、遗传、饮食、生活方式、微生物等多种因素相关[2-4]。2012年，Castellarin等[5]通过微生物基因组分析表明具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)在CRC组织中富集。Fn是定植于人类口腔中的一种革兰阴性厌氧菌，由此，口腔微生物与CRC的相关性备受关注。本文就口腔微生物与CRC的关系进行综述。

1 口腔微生物概述

1.1 口腔微生物的组成

口腔微生物包括细菌、病毒、真菌等，主要以细菌为主。口腔是人体五大细菌定植地之一，口腔内温度和pH值的稳定为菌群提供无害环境，唾液的不断滋润能促进微生物因子循环。口腔菌群存在于牙齿、黏膜、龈沟及唾液中，但其并非固定于口腔内，还能移行至全身其他部位引起感染及局部炎症反应[6]。定植于口腔内的细菌700余种，94%以上的口腔菌群由厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门、放线菌门、梭菌门及螺旋菌门组成[7]。

1.2 口腔微生物群落的作用

口腔微生物区系的成员通过形成生物膜即复杂的微生物群落而共存共生。无论是厌氧菌还是需氧菌，在这种共存共生的状态下，都能维持口腔生态系统的动态平衡，其对环境的刺激具有抵抗力，由此在病原体与共生菌之间形成平衡。在口腔微生物区系的生理状态下，大多数的结合位点被共生菌占据，从而阻止了病原体的生长，当这种状态被打破，口腔生态系统的平衡被破坏，可能会引发病原体的感染，对宿主产生不利的影响。

2 口腔微生物与CRC的关系

2.1 CRC中检出口腔微生物

多项研究证实CRC组织中能分离出Fn[8-9]，梭菌属和Fn在CRC中富集[10-11]，提示Fn与CRC的发生发展有着密切关系。研究发现Fn在结肠腺瘤中过度增殖，且Fn的富集与腺瘤-癌序列模型一致，提示Fn在CRC发展初期起重要作用[12-13]。另外在Fn丰度与肿瘤位置的关系方面，有研究显示盲肠中Fn的比例高于直肠[14]。随着研究的开展，越来越多的口腔微生物在CRC中被检测出，Nakatsu等[15]研究了腺瘤、CRC及健康人体的肠道微生物群落特征，检测到大量来源于口腔的细菌，包括梭杆菌、孪生球菌、消化链球菌及单胞菌属，提示动态共生的群落与CRC的发生有着密切关联。

2.2 口腔微生物的传播与定植

Komiya等[16]采用PCR分型菌株的方法对CRC患者的肿瘤及唾液样本进行研究，结果显示42.9%患者的肿瘤和唾液样本中检测到相同的Fn，提示CRC中的Fn起源于口腔。众多研究证实口腔微生物与CRC之间的关联，但是口腔微生物如何转移至肠道的确切机制尚未明确。有研究提出通过持续吞咽将口腔菌群转移至肠道[17]。人类的唾液中含有大量的口腔微生物，口腔细菌能够抵抗酸性胃环境而生存[18]。然而，由于胃肠道的屏障功能，吞咽的口腔微生物很少到达并定植于健康肠道，肠道微生物群对异位定植的抵抗力是阻止口腔微生物定植肠道的主要障碍。Kitamoto等[19]认为引起肠道微生物失调的多种因素，如抗生素的使用不当、肠道炎症、不合理饮食、人工甜味剂等均可能会增加口腔微生物定植肠道的机会，综合上述因素，肠道菌群失调可能是口腔致病菌异位定植的先决条件。

研究表明CRC组织过度表达特定的糖残基Gal-GalNAc能够被Fn表面黏附素Fap2识别，Fn依赖Fap2经血循环途径富集到CRC细胞的表面[20]。但在CRC初期，在Gal-GalNAc过表达之前，已经在CRC组织中发现Fn，由此说明口腔微生物可以通过多种途径转移。亦有研究表明口腔微生物可以在刷牙、拔牙或咀嚼这些活动中直接进入血液[21]。A bed等[22]比较了小鼠正交异性CRC模型在管饲和静脉接种Fn的方法下CRC定植的情况，结果显示静脉接种法比管饲法定植Fn更为成功，提示Fn经血循环途径传播比消化道传播更有效。从生物学角度看，血循环途径可能是口腔微生物通往肠道的首选途径，因为该途径避免了胃低pH值胃酸及胆汁酸的作用，口腔微生物也摆脱了与内源性结肠微生物群的竞争，但具体传播机制目前尚未明确，Jawad等[22]认为该过程很可能发生在口腔的瞬时菌血症期间。Fardini等[23]认为越过内皮屏障是血源性传播的关键步骤，其研究表明，Fn的黏附素FadA可通过血管内皮钙黏着蛋白受体与内皮特异性地相互作用，血管内皮通透性增加，促使Fn能顺利通过；Fn还是一种潜在的“启动子”微生物，其可以促进其他细菌穿过内皮。口腔微生物还有一种传播途径是通过代谢产物入血，引起全身低度炎症状态，从而促进消化道疾病的发生发展[24]。

2.3 口腔微生物在CRC中的作用

2.3.1 Fn促进CRC发生发展 Fn是目前研究最多的与CRC相关的口腔微生物，其在CRC的发展[25]、转移[26]及疾病结果[27]中发挥作用。Yang等[28]研究显示，Fn通过激活Toll样受体4(TLR4)来激活核因子(NF)-κB通路，使细胞内miRNA-21表达增加，从而促进小鼠肠道中肿瘤细胞的增殖。Rubinstein等[29]发现，Fn的毒性蛋白FadA与肠上皮细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)结合，激活β-catenin信号通路，增强Wnt转录活性，促进炎性因子和癌细胞的增殖。当肿瘤形成后，Fn表达的Fap2定位到表面高表达Gal-GalNAc的肿瘤细胞上，使Fn在肿瘤部位富集。在免疫功能方面，自然杀伤(NK)细胞的主要功能是抑制肿瘤，但它和其他免疫细胞能被T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域(TIGIT)受体抑制，Fn表面的Fap2可以与TIGIT受体结合以抑制NK细胞等免疫细胞的细胞毒性作用，从而保护肿瘤细胞不被杀死[30]。另外，巨噬细胞在肿瘤的发生发展中起重要作用，巨噬细胞可以分化为两种不同的表型(M1与M2)，M1表型具有阻碍肿瘤发展的作用，M2表型则具有促进肿瘤增殖的作用。Chen等[31]研究表明，Fn通过TLR4促进巨噬细胞M2表型极化，使小鼠的CRC生长。代谢产物方面，Kezuka等[32]研究证明Fn中的两个独特基因Fn1055与Fn1220能够生成硫化氢(H2S)，H2S是一种气体信号分子，具有促进肿瘤细胞增殖和扩散的作用。

2.3.2 口腔微生物群落促进CRC发生发展 虽然众多研究表明Fn与CRC的发生发展有着重要关系，但由于口腔微生物的复杂性，CRC的发展可能还与其他口腔微生物有关。王晴萱等[33]研究发现牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)与Fn可以协同感染并影响人口腔表皮样癌(KB)细胞的细胞周期，从而促进炎性因子分泌。除了Fn与Pg外，其他一些口腔微生物也不断在CRC中富集。

Schmidt等[34]在菌株水平分析了细菌从口入肠的情况，证实肠道中定植的部分机会致病菌来自口腔菌群，提示口腔菌群对肠道菌群具有影响。口腔和肠道菌群的一些成员可以形成一个由微生物和聚合基质组成的多层结构，即生物膜。已有研究从健康结直肠黏膜和CRC肿瘤中分离出含有口腔微生物的生物膜[35]。口腔微生物区系的成员与肠道菌群失调相关，其能扩散到肠道从而间接影响肠道微生物区系的组成。肠黏液屏障是覆盖在结肠上皮的凝胶型网状结构，由黏蛋白(MUC)(主要为MUC2)、抗菌肽、水、无机盐及免疫分子等构成，具有抗感染、免疫作用等功能。MUC2可以为益生菌提供结合位点以使其定植于肠内，益生菌能增加黏蛋白的分泌量来增强肠黏液屏障功能，从而减少致病菌的黏附。MUC2也可以为分泌型免疫球蛋白A和抗菌肽提供结合位点，增强肠黏液屏障功能[36]。在肠道菌群失调的过程中，细菌致病性增加，使得MUC2和抗菌肽合成下调，导致肠道生物膜形成。这些细菌生物膜与结肠上皮微生物附着、微生物侵袭增强、炎症及异常免疫反应相关，因此增加了细胞毒性或遗传毒性[37]。这些现象最终导致上皮细胞增殖和结直肠肿瘤的发生[35]。

真菌作为口腔微生物的重要组成部分，由于其相对较少的丰度和培养难度而被忽视。但最近有研究证实真菌菌群促进胰腺导管腺癌的发生发展[38]，提示真菌与消化道疾病的发生相关。霉菌毒素是真菌的次生代谢产物，膳食中的霉菌毒素与消化道肿瘤相关[39]。暴露于霉菌毒素会影响细胞凋亡、肠屏障完整性和黏液生成,引起DNA损伤，由此推测霉菌毒素可能在CRC的发生发展中发挥作用。Trojanowska等[40]在炎性肠病患者的口腔和结肠中发现了基因相同的白色念珠菌菌株，但关于口腔真菌定植与CRC关系的研究很少，有关生物膜与CRC之间的关联目前还没有深入研究。

在代谢方面，口腔菌群的结肠生物膜能够合成致癌代谢物、活性氧及多胺，从而进一步损害结肠[41]。研究显示多胺代谢产物精胺和双乙酰精胺的上调能引起结肠组织中DNA的损伤[42]。多胺不仅对生物膜的形成至关重要，而且能促进肿瘤的增殖[43]。因此，口腔微生物群落能产生必要的代谢产物来支持其生物膜的完整性，同时恶化肠道新陈代谢，刺激肿瘤增殖[41-42]。另外，一些能增加CRC风险的相关物质会被口腔微生物代谢成危险的化合物，例如多种链球菌能够通过乙醇脱氢酶(ADH)代谢将乙醇转化为乙醛[44]，而乙醛是一种致癌物。

Flynn等[45]提出一个多微生物协同作用的模型来说明口腔微生物诱导CRC发生的过程。首先，口腔菌群通过肠道微生物区系的改变而定植于肠道黏膜上，如Fn入侵细菌破坏上皮屏障，同时将早期和晚期定植的微生物联系起来，这些口腔微生物通过产生氨和H2S来改变pH值并促进炎症。随后微环境的变化促进了其他口腔菌种的生长和生物膜的形成，这些病原体与Fn一同产生毒力因子，扰乱上皮细胞信号转导与连接，从而改变肠道的通透性，促进转化和肿瘤发生。因此，CRC的发生更多地依靠口腔微生物群落的结构和代谢活动，而不单是一个特定的病原体。

CRC患者免疫力低下，各种机会致病菌在口腔大量增殖，打破了口腔的微生态平衡。董艳玲等[46]研究发现结肠癌患者口腔中Fn感染率及感染程度均高于健康人群。因此，口腔微生物的变化究竟是CRC的原因还是结果尚需更多的研究。

2.4 口腔微生物对CRC的诊断作用

癌症晚期才被确诊的患者，其生存质量往往已经受到严重影响，所以癌症的早期诊断和分期尤为重要。Chen等[47]通过系统评价表明口腔微生物检测可作为胃肠道癌的早期预测与预防途径。临床上常用粪便隐血试验筛查CRC，但是该试验不具备特异性，除了CRC外，其他许多疾病都可以出现粪便隐血试验阳性。在粪便隐血试验的基础上，添加Fn丰度检查，可提高CRC诊断的准确性。另外，检测血清中Fn的免疫球蛋白A或免疫球蛋白G抗体也有助于CRC的诊断[48]。但是，Fn的遗传和抗原多样性及牙周炎或其他梭杆菌的感染病史不可忽略，这些因素将影响检验结果的准确性[20]。Zhang等[49]通过比较CRC患者、结直肠腺瘤患者及健康志愿者的口腔微生物群，结果显示通过检测口腔微生物标志物能够区分结直肠肿瘤和健康人群，但该研究有局限性，且生物标志物对种族的依赖度高，需要在大样本人群中验证，并进行多中心研究。而且，上述的诊断指标还需要进一步验证其特异性与敏感性。

2.5 口腔微生物对CRC的治疗及预后作用

Yamaoka等[50]研究显示Fn丰度在Ⅳ期CRC患者中明显升高，Fn丰度较高的CRC患者，其肿瘤更大，存活时间更短，提示Fn的丰度能够预测CRC患者的预后。另外，Li等[51]研究显示，在高Fn丰度的88例患者中，有52例(59.1%)存在淋巴结转移，在Fn丰度较低的13例患者中，无淋巴结转移患者，表明高含量的Fn与CRC进展及转移有关。所以进行针对Fn的治疗将有助于治疗CRC，大多数Fn临床分离株对多数抗生素敏感，尤其是使用甲硝唑能使肿瘤体积显著减小[25]，但是甲硝唑广泛靶向厌氧菌，厌氧菌改善了放化疗的反应，因此该干预方法并不完善，发现仅针对肿瘤组织又对Fn有特异性的窄谱抗生素将具有重大意义。同时深入研究口腔微生物对CRC发生发展的作用机制，针对相关微生物进行靶向治疗将有利于CRC的诊治。

3 总结

众多研究证实口腔微生物与CRC的发生发展密切相关，尤其是Fn，不仅在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，而且在CRC诊断及治疗中的价值亦逐渐凸显。此外，Fn以外其他口腔微生物的毒力因子、代谢活动及生物膜也创造了CRC发展的微环境。口腔微生物传播至结直肠，成为潜在致病微生物区系的一部分，合成生长和毒力因子，逐渐消灭有益菌群，造成微生物区系的失衡，从而有利于口腔致病菌发挥优势，导致肠道微生物失调、黏膜粘连及生物膜的形成，伴随有毒代谢物浓度的增加及蛋白水解活性的增强，破坏结肠屏障的完整性，导致炎症与CRC的发生，进一步了解口腔微生物与CRC的关系，针对口腔微生物区系进行治疗，将为CRC的治疗提供一条新的途径。然而，口腔微生态的失衡与口腔微生物的异常定植究竟是CRC的原因还是结果仍然不清楚，需要更多的研究深入探讨。随着大数据研究及宏基因组技术的进步，应用分子生物学和更先进的培养技术，开展口腔微生物对CRC的预测及微生态防治的研究，将为CRC的预防、诊断、治疗及预后提供更大的研究价值。