尿源性干细胞对急性肾损伤的保护作用及机制研究进展*

杨博鑫，杨 硕 综述，崔丽艳 审校

北京大学第三医院检验科，北京 100191

急性肾损伤(AKI)是由多种病因和病理生理机制引起的致死率很高的疾病，以肾功能迅速下降为特点，同时伴有代谢物潴留和水电解质和酸碱平衡失衡。临床上AKI主要发生于脓毒血症、急性缺血或缺氧后、服用肾毒性药物等情况。流行病学调查结果显示，AKI发病率约为0.5%，住院患者发病率约为5.0%，重症监护病房患者发病率为30%～50%[1]。由于对AKI的修复机制不清楚，所以治疗手段有限[2]。临床实践中排除病因和肾脏替代治疗是目前主要的治疗策略，但是AKI病死率仍然很高，为25%～80%[2]。因此，找到一种更加有效的AKI治疗手段，对降低患者病死率、改善预后至关重要。

近年来，干细胞在再生医学、细胞治疗等领域应用广泛，干细胞的作用包括抗凋亡、抗肿瘤和新生血管作用等。已证实不同来源的干细胞可以改善AKI患者肾功能和肾脏病理形态，但是在临床应用中仍存在问题。例如，胚胎干细胞的应用存在伦理问题，骨髓和脂肪来源的间充质干细胞取材有创且相对较困难，原料稀有，成本较高。而尿源性干细胞 (USCs))有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，且从健康人尿液中即可提取，取材简单，成本较低，与泌尿系统高度同源，通常不发生免疫排斥反应，因此，其在泌尿系统疾病的治疗中有非常广阔的应用前景。

1 USCs的来源、分离与鉴定

USCs是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的自体干细胞。体外实验表明，USCs可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、功能上皮细胞和神经细胞等[3]。USCs还可以通过分泌多种营养因子，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子和肝脏生长因子等产生旁分泌效应，促进细胞修复，同时，USCs还具有调节免疫系统和诱导周围细胞旁分泌效应的能力[4]。动物试验证实，利用USCs治疗可以有效减少组织损伤，促进组织修复，同时改善器官组织功能[5]。USCs作为新型的干细胞来源，由于其在组织损伤修复中的优势，已成为当今研究的热点。

1.1USCs的来源 ZHANG等[6]于2008年从100 mL无菌尿液中成功提取分离出2～7个祖细胞，命名为“尿源祖细胞”，随后发现这类细胞有类似间充质干细胞跨胚层多向分化的特征，所以改命名为“尿源性干细胞”。有研究将男性肾脏移植入女性体内后收集女性患者的USCs，发现其USCs中含有Y染色体，由此说明USCs来源于肾脏[7]。

目前，USCs的培养方法是首先将尿液装入50 mL无菌离心管中，离心力400×g，离心10 min，其目的是去除尿液中脱落的上皮细胞和可能对实验产生干扰的物质。磷酸盐缓冲液(PBS)润洗后，将沉淀悬浮在DMEM细胞培养基中，同时在培养基中补充加入10%胎牛血清、10 ng/mL人类表皮生长因子、2 ng/mL血小板源性生长因子、1 ng/mL转化生长因子、2 ng/mL纤维细胞生长因子、0.5 μmol/mL氢化可的松、25 μg/mL胰岛素、20 μg/mL转铁蛋白、549 ng/mL肾上腺素、50 ng/mL三碘甲状腺原氨酸和20 U/mL抗菌药物。将细胞悬液移入细胞培养瓶中，37 ℃、5%CO2潮湿环境下培养细胞[8]。开始培养1～3 d后，培养基表面会漂浮大量死细胞和血细胞，所以前3 d培养基应该每天更换一次，3 d后，隔天更换一次[4]。有研究表明，将USCs在选择性培养基中培养1～2周，并在倒置显微镜下进行观察，可见极少量USCs(每50 mL尿液中有2～4个USCs)，USCs呈梭型。继续培养2周后细胞融合达到80%～90%时传代，传代后生长极其迅速，有非常强的增殖能力[8]。

1.2USCs的分离与鉴定 USCs的鉴定包括细胞学形态、细胞表面抗原、RNA端粒酶活性、核型、分化潜能等。USCs的外观呈米粒样，具有较长的端粒，在增殖过程中端粒可以保持稳定。USCs在表达间充质干细胞时具有的细胞表面标志物有CD29、CD44、CD54、CD90、CD105、CD117、CD133、CD146、SSEA4等；不表达的细胞表面标志物有CD14、CD19、CD31、CD45、人类白细胞抗原-DR、主要组织相容性复合体Ⅱ等[9]。采用流式细胞术可对其表面标志物进行鉴定。USCs同时还有多能转化潜能，其在不同的培养基中可以转化为不同种类的细胞，例如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、神经元细胞等[10-12]。

2 USCs对AKI的保护作用

有研究证明，在不同病因导致的大鼠、猪或猿的AKI模型中，利用USCs修复肾组织起到了明显的改善及保护作用[13-14]。例如在顺铂导致的AKI动物模型中，利用USCs治疗组尿素、肌酐、肾脏损伤指数等评估肾脏功能的指标均明显低于PBS对照组。糖原染色和凋亡染色结果显示，USCs治疗组的肾小管上皮细胞损伤程度轻于PBS对照组，同时肿瘤坏死因子-α、BCL-2蛋白等凋亡因子及白细胞介素-6等炎症因子表达水平也明显降低[15]。USCs在缺血再灌注导致的AKI中也起到了明显的保护作用和修复功能[16]。有研究发现，USCs治疗组除可以明显降低肌酐、尿素、肾脏损伤指数外，还可以明显降低干扰素-γ和白细胞介素-1β的表达水平。USCs在脓毒血症引起的AKI中也有较好的保护作用[17]，脓毒血症诱导AKI发生时表现为全身血管扩张伴低血压、肾脏低血流灌注、肾小管间质损伤和肾小管内皮功能障碍伴毛细血管血栓形成。USCs通过调节辅助性T细胞比例、调控脓毒症免疫应答，从而治疗AKI。USCs主要通过抗炎、抗凋亡的细胞保护作用，同时抑制组织损伤，从而对AKI起保护作用。

3 USCs对AKI的保护机制

USCs在AKI动物模型中有较好的保护效果，而USCs对AKI的保护作用是如何实现的呢？有研究提出，USCs分泌的外泌体可能在其中发挥了关键作用[8]。外泌体是一种被双层薄膜包裹的囊泡，直径为30～120 nm，可以通过超高速连续离心的方法提取，其在细胞稳态和细胞间通讯中发挥重要作用。USCs可通过降低半胱天冬酶促进有丝分裂作用，达到抗细胞凋亡和抑制细胞损伤的作用。添加USCs外泌体的培养基可以促进成纤维细胞、内皮细胞、血管的增殖，同时增强成骨功能并抑制破骨功能，从而促进骨组织的增殖。外泌体对癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病等均有治疗疗效，其在细胞增殖、炎症、免疫调节、血管反应、细胞凋亡等细胞生物行为调控中发挥重要作用；同时，外泌体还涉及疾病诊断与预后、药物递送等重要医学前沿领域[18]。

外泌体富含蛋白质、DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)、环状 RNA(circRNA)等，这些物质如果直接暴露在血液和体液中很容易被降解，而由磷脂双分子层组成的外泌体为它们提供了一个安全的载体，这些物质可以作为介质被靶细胞(如巨噬细胞、肾小管上皮细胞、内皮细胞)摄取吸收，从而调节AKI的损伤过程[19]。有研究报道，AKI的修复主要是通过USCs的旁分泌机制实现的，而外泌体正是实现旁分泌机制的重要工具[20]。USCs外泌体可以降低促炎因子(肿瘤坏死因子-α、干扰素γ、白细胞介素-6、白细胞介素-1β)水平，同时升高抗炎因子(白细胞介素-10与转化生长因子-β1)水平，降低氧化应激和胶原沉积水平[16]。外泌体利用细胞外囊泡介导生物活性内容物，例如脂质、蛋白质和RNA至损伤部位，从而达到减少肾小管损伤和细胞凋亡，同时抑制肾脏局部炎症的目的[21]。有研究证明，给予AKI小鼠模型的腹腔注射USCs与直接注射入肾脏的USCs均可以减轻AKI造成的损伤，同时促进修复[22]，说明USCs可以通过旁分泌机制治疗AKI。外泌体内容物治疗AKI的机制是当前研究的热点，其中对于治疗AKI研究较广泛的是miRNA和circRNA。

miRNA是由19～23个核苷酸组成的非编码内源性单链RNA，其由核内编码的miRNA基因转录为miRNA前体，然后在解螺旋酶和Dicer酶作用下生成单链miRNA，在生物体内可以稳定存在。外泌体中的miRNA通过降低某些生物标志物的释放，抑制或增强通路，从而实现细胞修复功能。有研究表明，USCs来源的外泌体可以释放miR-216a-5p，靶向作用于同源性张力蛋白磷酸酶，激活苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路，促进AKT磷酸化，同时降低半胱天冬酶3的表达，抑制细胞凋亡[8]。而添加miR-216a-5p拮抗剂的USCs对细胞的抗凋亡、抗损伤作用则大大降低，证明USCs通过外泌体传递miR-216a-5p对AKI发挥保护作用。有研究显示，miR-30c-5p可以靶向作用于硫氧还蛋白相互作用蛋白，通过抑制炎症小体NLRP3通路减少凋亡相关斑点样蛋白和半胱天冬酶1等因子的表达，最终达到抗炎、抗凋亡的作用[23]。另外，USCs外泌体中富含的miR-146a-5p还可以下调白细胞介素-1受体相关激酶Ⅰ，通过抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强通路p65核转位，减轻肾小管上皮细胞的损伤[21]。

circRNA作为miRNA 的分子海绵，竞争性结合miRNA的结合位点，使miRNA失去其自身功能及对下游靶基因的调节功能[24]，同样影响人类多种致病过程，例如心肌梗死、视网膜血管功能障碍、糖尿病、癌症、精神疾病等[25]。circRNA属于目前新的研究热点，但其在AKI发生和发展中的作用机制及其在USCs保护作用中所扮演的角色亟待人们去探索和研究。转录组测序技术显示，1 664个circRNA在人类肾脏组织中呈明显高表达，474个circRNA是肾脏中唯一表达的circRNA[26]。有研究发现，在大鼠高血压模型的肾脏组织中有多达超过12 000个circRNA分子表达[27]。在缺血再灌注损伤引起的AKI模型中，有许多差异表达的circRNA，如circ-DNMT3A、circ-AKT3、circ-PLEKHA7和circ-ME1[24]。而在脓毒血症引起的AKI细胞模型中，circ-FANCA表达上调，来自脂多糖处理过的人肾小管上皮细胞的外泌体参与了circ-FANCA的体外传递。敲除circ-FANCA可以靶向作用于miR-93-5p，调控氧化应激反应蛋白1的表达，促进细胞增殖，减少细胞凋亡、炎症和氧化应激反应，进而减轻脂多糖诱导的HK2细胞损伤[28]。在AKI中circRNA的表达谱及其调控机制有待进一步深入研究，而USCs是否可以靶向调控circRNA、减轻AKI尚需探索。

4 总结与展望

AKI由于出现突然性的肾功能恶化，目前缺乏特效治疗方法，病死率较高。USCs具有采集简单，成本低廉等优点，并且对于多种疾病的治疗均有明显效果。USCs在各种AKI的细胞和动物模型中均发挥保护作用，其主要机制之一是利用USCs外泌体介导生物活性物质至损伤部位，发挥抗炎、抗凋亡作用。miRNA、circRNA等在AKI的发病和调控中起重要作用，可能成为AKI治疗的关键靶点。USCs可以通过外泌体传递miRNA、circRNA等重要分子，为AKI的治疗提供新思路。