Mex3c参与调控小鼠肾小管细胞瘦素及其瘦素受体的表达

李婷 路志国 邢欣然 尹荷晴 李美港 鲁瑶 杜勇

1宁夏医科大学临床学院（银川 750003）；2宁夏医科大学总医院小儿外科（银川 750003）

下丘脑是能量代谢中枢，高脂饮食（HFD）会刺激下丘脑内小胶质细胞和酸性纤维蛋白增加［1］。发现秀丽隐杆线虫肌肉表达物3（Mex3c）杂合小鼠可以通过降低食欲和增加活动量导致机体形成负能量状态［2］；研究表明Mex3c+/-小鼠的肾小球存在固缩现象，但其纤维化程度低［3］，高脂饮食的肾脏功能损伤、纤维化、且尿激酶纤溶酶原激活剂下降和滤过率降低［4］。本研究旨在探讨不同能量状态诱导的瘦素（leptin）蛋白在肾小管细胞中的表达作用，特别是Mex3c 对肾脏组织及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验动物FVB/N雌鼠18只，包括采用CRISPR/Cas9［5］技术构建Mex3c 小鼠6 只。对照组（普通饲料，n=6）、Mex3c 组（普通饲料，n=6）、高脂饮食组（HFD 组；高脂饲料，n=6）。

1.2 试剂AxyPrep总RNA小量制备试剂盒、cDNA转录试剂盒（全式金），全蛋白提取试剂盒（凯基生物），leptin 抗体、瘦素受体（leptin receptor，LEPR）抗体（Abcam），兔二步法检测试剂盒、β-actin 抗体、DAB显色试剂盒（中杉金桥），ECL（Advansta 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 一般指标和标本采集从4 周龄起测定体质量（禁食水8 h）、进水量、进食量。在14 周龄时腹部注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，留取血清；获取实验标本。

1.3.2 光镜观察取小鼠肝脏、脂肪及肾组织制成的4 μm 石蜡切片，苏木素伊红染色后并在光镜显微镜下观察组织形态。按免疫组化两步法检测肾组织leptin、LEPR 蛋白表达，分析其光密度值。

1.3.3 蛋白印迹实验取40 mg肾组织，提取蛋白并测蛋白浓度；按照蛋白印迹实验步骤，获取蛋白条带；分别孵育β-actin（1∶5 000）、leptin（1∶3 000）、LEPR（1∶2 000）、4 ℃过夜，常温孵育二抗1 h（1∶10 000），ECL显色曝光，经Image J软件分析蛋白灰度值。

1.3.4 mRNA 提取盒cDNA 转录取40 mg 的肾脏组织，提取RNA，根据qPCR 试剂盒获取cDNA；反应条件42 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s。引物序列LEPR：正义链5′-CGTGGTCAGAAGATGTGG-3′，反义链5′-CAGGAAAGGATGACAGC-3′；leptin 正义链5′-TGTTCAAGCAGTGCCTATCC-3′，反义链5′-GGACCTGTTGATAGACTGCCA-3′。

1.3.5 酶标仪法检测甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）及LEPR 和肌酐。

1.4 统计学分析使用SPSS 16.0 统计软件进行分析。计量数据以（）形式表示并采用单因素方差分析和t检验；HDL/LDL/TG 为偏态分布采用Kruskal-WallisH检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况三组小鼠在14 周龄体质量：对照组（17.93±0.93）g、Mex3c组（15.40±0.10）g、HFD组（22.50 ± 0.95）g；与对照组体质量相比，HFD 组高（P＜0.001），Mex3c 组低（P＜0.05）。与对照组进食量（5.03±1.04）g/d/只相比，HFD组小鼠的进食量多（6.59±1.36）g/d/只（P＜0.05），Mex3c组小鼠的进食量为（5.05±0.83）g/d/只（P＞0.05）；三组小鼠进水量差异无统计学意义。与对照组TG［（2.98±0.30）mmol/L］相比，Mex3c组TG水平较低［（2.19±0.43）mmol/L］、HFD 组TG 水平较高［（7.18 ± 1.26）mmol/L］（均P＜0.05）；与对照组HDL［（3.09 ± 1.05）mmol/L］相比，Mex3c 组HDL［（2.44 ± 0.18）mmol/L］低表达（P＞0.05）、HFD 组［（1.01 ± 0.09）mmol/L］低表达（P＜0.05）；与对照组LDL［（0.38 ± 0.14）mmol/L］相比，Mex3c组LDL低表达［（0.15±0.07）mmol/L］，HFD组LDL高表达［（1.08±0.05）mmol/L］（均P＜0.05）。

2.2 病理学染色与对照组相比，Mex3c 组的肝细胞排列整齐、空泡状和HFD 组肝细胞结构紊乱、大量空泡状。对照组和Mex3c 组脂肪细胞排列紧密、结构完整；但HFD 组细胞大且融合。与对照组相比，Mex3c 组和HFD 组中的肾小球与包囊之间的空隙变大，肾小管上皮细胞之间存在间断，不完整。见图1-3。

图1 三组小鼠肝脏组织HE 染色（×40）Fig.1 Hematoxylin and eosin staining in mice liver tissue of three groups（×40）

图2 三组小鼠腹部脂肪组织HE 染色（40×）Fig.2 Hematoxylin and eosin staining in mice abdome fat tissue of three groups（40×）

图3 三组小鼠肾脏组织HE 染色（40×）Fig.3 Hematoxylin and eosin staining in mice renal tissue of three groups（40×）

2.3 小鼠血清瘦素受体浓度与对照组［（1 971.70± 661.23）pg/mL］相比，Mex3c 组血清瘦素受体［（1 883.30±718.156）pg/mL］低表达（P=0.884），HFD组血清瘦素受体［（7 829.20 ± 1 985.41）pg/mL］高表达（P＜0.01）。

2.4 小鼠肾脏组织中leptin、LEPR 的mRNA 相对表达量在正常肾脏组织中未检测到leptin 的表达，与对照组相比，Mex3c 组（2.34 ± 0.36）高表达，HFD 组（2.61 ± 0.28）高表达（均P＜0.01）。与对照组的LEPR mRNA（1.02±0.01）相比，Mex3c 组（0.49 ± 0.23）和HFD 组（0.10 ± 0.03）均低表达（均P＜0.01）。

2.5 小鼠肾脏组织中leptin、LEPR 蛋白表达leptin 及LEPR 表达在肾小管细胞膜上呈棕黄色，见图4A；与对照组的leptin（0.15±0.04）相比，Mex3c组（0.19 ± 0.04，P＜0.01）和HFD 组均高表达（0.29±0.07，P＜0.001）。而LEPR 表达趋势与leptin 相反（P＜0.01）。与对照组LEPR 蛋白（0.31 ± 0.12）相比，Mex3c 组（0.19±0.06）和HFD组（0.13±0.05）均低表达（均P＜0.05），见图4B。

图4 三组小鼠肾脏组织中leptin、LEPR 蛋白表达情况Fig.4 The expression of leptin、LEPR protein in mice rend tissue of three group

2.6 小鼠血清中肌酐水平比较与对照组［（57.91±16.33）mmol/L］相比，Mex3c 组肌酐水平［（29.14±5.71）mmol/L］较低（P＜0.001），HFD 组肌酐水平［（124.73±18.54）mmol/L］较高（P＜0.001）。

3 讨论

Mex3c是含有泛素E3连接酶的RNA结合区域，在RNA 结构域的C 端［6］，且有两个hnRNP K 同源性结构域。Mex3c小鼠可降低食欲和增加自身活动量达到负能量状态，抵抗食物诱导的肥胖［7］。POETSCH等［8］发现肥胖或者心血管系统疾病中存在leptin抵抗或者leptin 信号通路缺乏是其发病因素之一。HE 染色显示Mex3c 组和HFD 组的肾小球存在缩小且肾小管上皮细胞有断裂现象，提示能量失衡影响肾脏结构。与对照组相比，HFD 组肌酐浓度较高，提示肾脏滤过功能下降；而Mex3c 组肌酐浓度较低，推测Mex3c 组小鼠处于负能量状态，影响合成肌酐。

对照组不表达leptin 的mRNA，低表达leptin 蛋白，说明肾脏组织的leptin 可能来自其他组织；HFD 组和Mex3c 组高表达leptin 的mRNA 和leptin蛋白，提示肾脏受损可能生成leptin 蛋白。CONSIDINE 等［9］发现血清中leptin 水平与体质量指数、体脂百分比、脂肪质量、脂肪细胞大小成正比，游离脂肪酸、雌激素、TNF-α 或者肾脏清除率受损会刺激分泌［10］。正常肾脏少量表达leptin，当其损伤时表达增多，特别是血清leptin 水平会逐渐升高产生leptin 抵抗［11］。HFD组血清中高表达LEPR，当血清中leptin 增高时，其受体伴随改变，GAO 等［12］发现高脂饮食致使下丘脑内星形胶质细胞活化导致炎症产生，大量甘油三酯进入下丘脑，抑制STAT3通路，诱导瘦素抵抗［13-14］。

研究表明脂代谢障碍在慢性肾脏病进程中起重要作用［15］。原型leptin 经肾小球滤过并被肾小管吸收降解，脂代谢紊乱诱导leptin 表达增多，与LEPR的结合具有高度特异性、饱和性、时间依赖性及可逆性，达到肾小管降解的最大饱和度，肾脏的功能受损影响leptin排泄，形成恶性循环。由Mex3c诱导的负能量平衡，肾脏组织中leptin、LEPR的表达有差异性；HE 染色中Mex3c 组和HFD 组中的肾小球变小及肾小管细胞存在断裂现象。目前对于Mex3c 及leptin 的研究还不是很全面。Mex3c 诱导leptin、LEPR的改变与肾小管细胞存在何种关系，还需探究。研究发现G蛋白偶联受体可以减轻肾小管上皮细胞凋亡，改善肾功［18］；将在后续实验测量尿蛋白、尿酸、尿素氮等完善实验，探究Mex3c 基因缺陷对肾脏功能影响。

综上，Mex3c 可以诱导小鼠肾脏细胞leptin 表达，血肌酐降低，肾小球变小，HFD 组血肌酐升高，肾功能损伤；但是否影响到肾脏的内分泌、水代谢功能、水电解质和酸碱平衡，进而影响到机体的内环境需进一步研究。