异丙酚抑制甲酰基肽受体1减轻脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤

李成洁，陈健，吴勇，陈爱鸾，沈伯雄

(1. 海南西部中心医院 麻醉科，儋州 571700；2. 上海第九人民医院 麻醉科，上海 200011)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床病情危重患者的常见并发症[1]。2018年美国重症医学会公布的危重患者管理方案建议，对此类患者应尽量减少连续或间歇性镇静[2]。然而，对患气道过敏危重病的患者，需要使用镇静剂扩张支气管并尽量减少其应激反应。异丙酚是最常用的静脉麻醉药物之一，主要用于麻醉的诱导和维持以及重症监护室的镇静治疗。近年来研究发现异丙酚具有抑炎作用，如抑制单核/巨噬细胞和中性粒细胞的免疫活性，抑制促炎细胞因子的产生并减少一氧化氮的生物合成[3-4]。这一抑炎特性可能有利于危重患者ALI病情的缓解。然而，异丙酚发挥抑炎作用的机制尚不清楚。线粒体来源的N-甲酰化肽在组织或细胞损伤后迅速被释放；该分子是强化学诱导剂，能够激活甲酰基肽受体1(formyl peptide receptor 1，FPR1)并触发免疫细胞的多种功能，包括趋化、脱颗粒、活性氧类生成和吞噬作用，引发和加重炎症反应[5]。以往研究表明，异丙酚是N-甲酰化肽的竞争性抑制剂，通过阻断FPR1发挥作用，但尚不清楚异丙酚是否通过阻断FPR1改善危重患者的ALI病情[6]。本研究中，我们假设异丙酚通过抑制内源性N-甲酰化肽诱导的炎症反应改善危重症患者的肺部损伤。为验证该假设，研究探讨了异丙酚在脓毒症诱导的ALI小鼠模型中的保护作用，并通过体外试验观察异丙酚对FPR1激动剂诱导的人中性粒细胞活化的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 样本、材料、药品、试剂与仪器12例健康体检受试者静脉血，采集自海南西部中心医院。SPF级BALB/c小鼠(40只，雄性，体质量20～25 g，7～8周龄)，购自广东省医学实验动物中心。异丙酚粉末(2，6-二异丙基苯酚)，购自Sigma-Aldrich公司。兔抗鼠磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抗体和山羊抗兔IgG-HRP二抗，均购自CST公司。兔抗鼠FPR1和Ly6G抗体，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒及N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF，FPR1激动剂)，购自R&D SYSTEMS公司。N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-缬氨酸对硝基酰苯胺[L-Valinamide， N-(4-methoxy-1， 4-dioxobutyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-N-(4-nitrophenyl)， N-Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val4-nitroanilide]，购自Tocris Bioscience公司。Western blotting检测试剂，购自安玛西亚中国有限公司。所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich公司。BX51显微镜，来自奥林巴斯(中国)有限公司；UV-2700双光束紫外分光光度计，来自岛津公司。

1.2 小鼠LPS诱导脓毒症模型的建立于25 ℃恒温环境饲养小鼠，自由饮食饮水并给予12 h/12 h昼夜明暗交替。适应性饲养小鼠1周后进行实验。将实验小鼠随机分为4组，每组10只：1组为用50 μL 10% 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)处理的假手术(sham)小鼠；2组为用50 μL异丙酚(40 mg/kg)处理的假手术小鼠；3组为用50 μL 10% DMSO处理的脓毒症小鼠；4组为用50 μL异丙酚(40 mg/kg)处理的脓毒症小鼠。将异丙酚粉末溶解于DMSO，后用生理盐水稀释。模型组小鼠每隔30 min腹腔注射1次DMSO或异丙酚，共治疗3次。第2次注射DMSO或异丙酚后，经腹腔单次注射200 μL LPS(10 mg/kg，提取自大肠埃希菌，血清型：O111：B4)或相同体积0.9%生理盐水(假手术组)。脓毒症模型鼠于注射LPS后20 h处死。固定小鼠，取右肺上叶2段于10%中性福尔马林中固定；制备石蜡组织块并切5 μm薄片，进行H-E和免疫组织化学染色。在生存研究中，每组设6只小鼠，脓毒症小鼠接受单剂量200 μL LPS(10 mg/kg)腹腔注射建模，同时治疗组给予腹腔注射50 μL异丙酚(设2个剂量：20或40 mg/kg)，连续监测7 d并统计小鼠的生存率。

1.3 H-E和免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡，用3%过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化物酶。于室温条件用山羊血清封闭切片15 min，后用蒸馏水和PBS各漂洗3次。于4 ℃条件下用抗FPR1抗体(1∶150)、抗Ly6G抗体(1∶150)过夜孵育切片，后用PBS漂洗2次。于室温条件下将切片与山羊抗兔IgG-HRP抗体(1∶500)共孵育20 min。PBS漂洗3次后，用二氨基联苯胺染色，苏木精复染。在BX51显微镜下观察切片及摄片，并用Image Pro Plus v6.0分析图像。

1.4 各组小鼠肺组织MPO活性的测定研究以肺组织中MPO活性作为中性粒细胞聚积数的衡量指标，用于评估肺组织中中性粒细胞的浸润情况。使用玻璃匀浆器在冷藏的pH值7.4的磷酸钾缓冲溶液中匀浆肺组织(使质量体积浓度为10%)。于4 ℃条件下以10 000×g离心匀浆20 min，收集上清液。使用MPO测定试剂盒评估肺组织中MPO的活性。所有步骤均按试剂盒说明书进行。

1.5 各组小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的分析于室温条件下向分离自每只大鼠的左肺支气管中注射0.5 mL PBS，反复抽吸3次后，收集BALF，重复操作3次，保证每次样本回收率超过80%。于4 ℃条件下按1 200×g离心BALF 10 min。将上清液分成小份(0.1 mL/份)，并于-70 ℃条件下保存，以便通过ELISA批量分析样本。使用小鼠TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒检测BALF样本中TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6水平。

1.6 人中性粒细胞样本的制备自20～30岁健康受试者捐献的肝素化静脉血(每位受试者取50 mL外周血)分离人中性粒细胞(受试者于采血前1周内未报告有全身性疾病)。根据文献[7]报道的方法分离人中性粒细胞。采用Ficoll密度梯度离心法离心血液样本，用低渗溶血法去除混杂的红细胞。实验前，将分离的中性粒细胞悬浮于pH值7.4的含Ca2+Hank＇s平衡盐溶液中，于4 ℃条件下保存。通过瑞氏-吉姆萨染色确定中性粒细胞悬液的纯度，经台盼蓝染色鉴定得细胞存活率>98%。

1.7 人中性粒细胞超氧阴离子释放的检测本研究使用可被超氧化物还原的铁细胞色素c评估人中性粒细胞中的超氧化物释放情况。将分离的中性粒细胞悬液(6×105个/mL)接种于含铁细胞色素c(0.5 mg/mL)和CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡盐溶液中，添加DMSO或异丙酚(5～100 μmol/L)处理5 min。然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒细胞。用UV-2700双光束紫外分光光度计连续监测铁细胞色素c还原引起的光密度[D(550 nm)]值的变化。超氧化物释放量的计算公式为：超氧化物释放量=[D(550 nm)含超氧化物歧化酶(100 U/mL)的反应-D(550 nm)无超氧化物歧化酶的反应]/ε还原形式铁细胞色素c的消光系数[8]。

1.8 人中性粒细胞弹性蛋白酶释放的检测本研究通过检测弹性蛋白酶释放评估活化中性粒细胞的脱颗粒情况。以N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-缬氨酸对硝基酰苯胺为弹性蛋白酶底物，将人中性粒细胞悬液(6×105个/mL)与底物(0.1 mmol/L)加入含CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡盐溶液中，添加DMSO或异丙酚(5～100 μmol/L)处理5 min，然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒细胞。使用UV-2700双光束紫外分光光度计连续监测D(405 nm)值的变化[8]。

1.9 Western blotting检测人中性粒细胞MAPK信号通路蛋白的表达用10%DMSO或异丙酚(50 μmol/L)处理人中性粒细胞5 min，添加fMLF(30 nmol/L)激动30 s，后将细胞置于冰上终止反应。于培养液中加入含有NaCl(100 mmol/L)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)(1 mmol/L)、HEPES(50 mmol/L、pH值7.4)、Na3VO4(钒酸钠，2 mmol/L)、对硝基苯基磷酸酯(10 mmol/L)、5% 2-巯基乙醇、苯甲磺酰氟化物(1 mmol/L)、1%蛋白酶抑制剂和1% Triton X-100的裂解缓冲液。于冰浴中采用超声波细胞破碎仪匀浆细胞，具体为超声5 s，停3 s，如此循环3～5次。于4 ℃条件下14 000×g离心20 min，收集上清液。通过SDS-PAGE将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜上，后用5%脱脂奶粉溶液封闭膜2 h，共孵育NC膜与山羊抗兔IgG-HRP。将Western blotting系统添加至NC膜，使用ImageJ软件分析条带灰度。

2 结果

2.1 异丙酚减轻脓毒症小鼠ALI并提高其存活率H-E染色结果显示，脓毒症诱导的ALI小鼠肺组织出现明显的病理改变如肺水肿、肺泡出血、肺泡壁增厚和炎症细胞浸润；然而，腹腔注射异丙酚缓解了肺组织的上述病理改变。免疫组织化学染色结果显示，脓毒症增加了小鼠肺组织FPR1和Ly6G蛋白表达，表明中性粒细胞浸润增加，而腹腔注射异丙酚可有效减少肺部因炎症引起的中性粒细胞浸润增加(图1B、1C)。此外，MPO活性是中性粒细胞浸润程度的定量指标，在脓毒症小鼠的肺组织中显著增加(P<0.001，图1D)；腹腔注射异丙酚则显著抑制了脓毒症小鼠肺部MPO活性的升高(P<0.01，图1D)。生存研究中，LPS注射后3 d内，本组小鼠存活率为0(图1E)。相比之下，LPS注射后87.5%(7/8)接受异丙酚(40 mg/kg)治疗的小鼠存活时间达7 d(图1E)。

注：A. 各组小鼠肺组织H-E染色(×200)；B. 各组小鼠免疫组织化学染色分析肺组织中FPR1蛋白表达水平(×200)；C. 各组小鼠免疫组织化学染色分析肺组织中Ly6G蛋白表达水平(×400)；D. 各组小鼠肺组织中MPO活性的测定；E. 各组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线分析。与假手术组相比，***P<0.001；与LPS组相比，##P<0.01。图1 异丙酚对脓毒症诱导ALI小鼠肺部损伤及存活率的影响

表1 异丙酚对脓毒症小鼠ALI模型BALF中炎性因子水平的影响

2.2 异丙酚抑制小鼠BALF中炎性因子的表达脓毒症小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL1表达水平显著增加(均P<0.01)，而腹腔注射异丙酚显著抑制了脓毒症小鼠BALF中上述细胞因子表达水平的升高(均P<0.05)。

2.3 异丙酚抑制fMLF诱导的人中性粒细胞弹性蛋白酶和超氧化物的释放中性粒细胞产生的超氧阴离子和弹性蛋白酶是杀死病原体的重要成分，其中涉及许多病理反应[9]。研究评估了异丙酚对中性粒细胞胞外弹性蛋白酶活化和超氧阴离子释放的影响。结果表明，异丙酚(5～100 μmol/L)剂量依赖性地降低弹性蛋白酶活性和超氧化物释放(均P<0.05，表2)。此外，异丙酚预处理使fMLF释放弹性蛋白酶和产生超氧阴离子的浓度响应曲线右移(图2A、2B)，提示异丙酚可能是FPR1的抑制剂。

表2 异丙酚对fMLF诱导的人中性粒细胞弹性蛋白酶活性和超氧化物释放的影响

注：A. 异丙酚对fMLF作用下中性粒细胞弹性蛋白酶活性的影响；B. 异丙酚对fMLF作用下中性粒细胞超氧化物释放量的影响。与DMSO组相比，**P<0.01，***P<0.001。图2 异丙酚对fMLF作用下中性粒细胞弹性蛋白酶活性及超氧化物释放的影响

2.4 异丙酚抑制fMLF诱导的人中性粒细胞MAPK信号通路蛋白磷酸化水平MAPK信号途径参与了FPR1下游信号通路的转导[10]。Western blotting检测结果示异丙酚显著减少了fMLF诱导的人中性粒细胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平(均P<0.001,图3)。

注：A. 各组人中性粒细胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化蛋白表达的Western blotting分析图；B. 各组人中性粒细胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的定量分析。与空白对照组相比，***P<0.001；与fMLF组相比，###P<0.001。图3 Western blotting检测异丙酚对fMLF诱导的人中性粒细胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的影响

3 讨论

异丙酚常用于危重症患者的镇静治疗。许多临床试验表明，异丙酚具有良好的抗氧化、抑炎、抗自由基等生物学作用[3-4]。据报道，异丙酚能有效降低患者术后认知功能障碍的发生率，维持机体适当的血流动力学状态，缩短患者重症监护病房的住院时间并提高大手术或心肺转流术患者的肺顺应性[11-12]。然而，异丙酚保护作用的详细分子机制仍不完全清楚。本研究中，异丙酚治疗显著改善了脓毒症诱导的小鼠肺部炎症反应和组织病理学改变，减少了肺部FPR1蛋白水平及中性粒细胞浸润。结果表明，异丙酚对脓毒症诱导的ALI小鼠肺部的保护作用可能与抑制FPR1上调有关。

越来越多的证据表明，中性粒细胞的积聚和活化是ALI的1个关键过程[13]。激活的人中性粒细胞可能通过增加炎症介质释放加重肺组织损伤，从而导致内皮功能障碍和气道重塑[14]。多种炎性介质，包括TNF-α、IL-1β和趋化因子，已被证明在ALI病程中参与上皮和内皮屏障的破坏。TNF-α、IL-1β、IL-6和CXC趋化因子家族的释放与中性粒细胞募集相关，并与ALI的严重程度和死亡率相关[15]。本研究中，异丙酚的应用可显著减少小鼠肺部炎性介质的产生，与其他显示异丙酚在各种体内外模型中具有抑炎作用的结论一致[16-17]。进一步的研究中，笔者发现异丙酚减少了脓毒症诱导的ALI小鼠肺部Ly6G蛋白水平，并且体外试验证明了其通过阻断FPR1抑制了fMLF诱导的中性粒细胞激活。FPR1是G蛋白偶联的7种跨膜受体之一，在炎症反应中发挥重要作用[18]。N-甲酰肽由细菌产生，或释放自损伤的线粒体，可通过与FPR1的结合刺激免疫细胞触发炎症反应[5]。研究发现，来自肝细胞线粒体的N-甲酰化肽作用于FPR1以触发趋化反应并诱导呼吸爆发[19]。线粒体产生的N-甲酰化肽可激活中性粒细胞，在Ca2+和ERK的作用下释放基质金属蛋白酶9和IL-8，并在肺组织中诱导炎症反应[20]。fMLF是1种释放自受损细胞线粒体的衍生的N-甲酰化肽，趋化FPR阳性白细胞向炎症部位浸润，参与诱导组织的早期损伤。本研究通过fMLF检测FPR1相关的中性粒细胞炎症反应情况。结果表明，异丙酚对fMLF激活的人中性粒细胞的超氧阴离子生成和弹性蛋白酶释放均有明显的抑制作用，表明异丙酚通过抑制中性粒细胞激活发挥抑炎作用。

此外，p38和ERK-MAPK是FPR1信号通路的下游介质，它们在FPR1激动剂作用于中性粒细胞时被强烈激活[21]。在小鼠脓毒症模型中，p38激活促进中性粒细胞的趋化性迁移；MAPK ERK/JNK激活诱发肺部炎症反应，导致肺损伤[18]。本研究通过Western blotting检测发现，异丙酚降低了fMLF诱导的ERK、p38和JNK磷酸化水平。上述结果表明，异丙酚可直接干扰fMLF与FPR1的相互作用，阻断下游信号通路，从而有效降低fMLF诱导的人中性粒细胞炎症反应水平。

综上，本研究发现，在以脓毒症为特征的小鼠ALI模型中，异丙酚给药改善了其肺功能，减轻了肺损伤，并下调了FPR1和Ly6G表达。进一步体外试验证实，异丙酚对fMLF诱导的人中性粒细胞活化的抑制作用是通过与FPR1结合介导的，具体是抑制了FPR1下游信号转导和炎症反应发生，如超氧化物和弹性蛋白酶的释放。因此，异丙酚可能对治疗患有脓毒症和脓毒症相关ALI的重症患者有实用价值。