响应曲面法优化富集桑叶γ-氨基丁酸工艺研究

靳迎春,汤彩云,姚 彤,屠 洁*,刘冠卉,刘 利,3,李 强

(1.江苏科技大学 生物技术学院, 镇江 212100) (2.江苏科技大学 粮食学院, 镇江 212100) (3.中国农业科学院 蚕业研究所农业部蚕桑遗传改良重点实验室, 镇江 212100)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种广泛存在于细菌、植物和脊椎动物中的非蛋白质氨基酸.动物体中的GABA是由三羧酸循环谷氨酸脱羧酶( glutamic acid decarboxylase，GAD)催化谷氨酸而成，被认为是中枢神经系统信号传导过程中最重要的抑制性神经递质，具有降血压、镇静、减少失眠等功效[1].许多植物体内也可通过GAD将谷氨酸转化为GABA，通常植物组织中GABA含量比较低，范围仅在3.1～20.6 μg/g，但是在盐、机械损伤、低温、高温和低氧等非生物胁迫下，能够显著提高GABA含量，从而参与植物代谢，调节生命活动[2-3].溶液浸泡法方便易行，是众多学者研究富集GABA常用的方法，在溶液中添加外源氨基酸，不仅造成了盐胁迫环境，还可以形成低氧的逆境，共同作用激活GAD活性，从而使GABA含量增加.文献[4]利用1%谷氨酸钠溶液对茶叶浸泡处理10 h，发现茶叶中GABA含量显著提升，达到0.624 mg/mL，为对照组的6.8倍.

桑树在我国是一种重要的经济作物，为药食两用资源，在我国约有四千年的栽培历史.目前在全国范围均可见桑树种植，其中主要集中在华南和西南地区，且在不同的地区具有典型的种质资源[5].桑叶作为蚕桑资源的副产品，含有丰富的营养和活性物质，具有降血糖、保护心血管、抗氧化、抗炎、提高免疫力等药理作用[6].研究发现，桑叶中富含GABA，尤其在嫩叶中含量较高，平均含量为0.77 mg/g，显著高于其他植物中GABA含量[7].文献[8]对不同品种桑叶GABA含量进行比较发现华南地区的典型种植资源育711品种的GABA含量显著高于其他品种.育711作为中国农业科学院自主选育的优质桑树品种，具有高抗性、高发芽率、高品质等优点，目前育711主要用于养蚕业，研究多集中在大田栽培表现和调查经济性状等方面，而对其桑叶活性成分没有充分的开发利用[9].因此，利用育711品种桑叶，挖掘新的富集GABA的生物材料，以开发富含GABA的功能性食品和保健品，对拓宽我国桑叶资源创新型研究具有一定的现实意义.

文中以育711品种桑叶为原材料，采用谷氨酸钠浸泡处理桑叶富集GABA.通过单因素和响应面实验对影响桑叶GABA含量的浸泡时间、浸泡温度、谷氨酸钠浓度等因素进行考察，并获得富集最佳工艺，为育711的深度开发提供一定理论依据.

1 实验

1.1 材料与试剂

桑叶均采自国家桑种质资源镇江桑园圃中3～4月份桑树(YU711)的2、3叶位.采摘后即刻洗净备用.

γ-氨基丁酸购自Sigma公司(美国)；谷氨酸钠(MSG)、十水合四硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)、重蒸酚、次氯酸钠、无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅SY601，天津欧诺有限公司；紫外分光光度计UV-2100，尤尼柯有限公司；酶标仪SpectraMaxi3，美国Molecular Devices公司；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A型，上海三发科技仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 GABA含量测定

参照文献[10]的方法，将桑叶粉浸入100 ℃蒸馏水中(m∶V=1 ∶40)，浸泡24 h(40 ℃)，每20 min摇动一次.水浴结束后取出用4层纱布过滤，滤液再经过0.45 μm滤膜过滤后即得桑叶提取液.桑叶GABA含量测定参考文献[11]的方法，采用比色法测定.

1.3.2 单因素实验设计

分别研究不同谷氨酸钠浓度(0，3，6，9，12 g/L)，不同浸泡温度(15，20，25，30，35 ℃)，不同浸泡时间(5，10，15，20，25 h)这3个因素对桑叶GABA富集效果的影响，每组实验做3次平行，取平均值.

1.3.3 响应曲面设计

根据单因素试验的结果，选择最佳的浸泡浓度、浸泡温度和浸泡时间.采用相关软件Design-Expert.V8.0的Box-Behnken设计方法对3个单因素进行优化，将优化后的数据进行多元回归拟合分析，得到最佳提取条件，并进行验证.每组实验重复 3 次.实验因素水平及其编码如表1.

表1 GABA富集工艺的优化实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 谷氨酸钠浓度对桑叶GABA富集的影响

控制浸泡时间为10 h，浸泡温度为30 ℃，考察浸泡过程中谷氨酸钠浓度为0～12 g/L时对桑叶GABA含量的影响.从图1可以看出，随着谷氨酸钠浓度的增加，桑叶中GABA含量呈现先上升后下降的趋势.当谷氨酸钠浓度为6 g/L时，桑叶GABA含量达到最高为3.152 mg/g，之后随着谷氨酸钠浓度的增加，桑叶GABA的积累量逐渐降低.谷氨酸钠作为GABA合成的前体物质，经谷氨酸脱羧酶生成GABA，适量的谷氨酸钠能够为GAD提供充足的底物促进GABA合成，但是当谷氨酸过度积累时，会对GABA合成通路起反馈抑制作用，降低桑叶中GABA含量.文献[12]研究也得到类似的结果，谷氨酸浓度过高时，会抑制GAD活性，导致GABA含量降低.因此富集桑叶GABA实验中谷氨酸钠最佳浓度为6 g/L.

图1 谷氨酸钠浓度对桑叶GABA含量的影响

2.1.2 浸泡温度对桑叶GABA富集的影响

控制谷氨酸钠浓度为3 g/L，浸泡时间为10 h，考察浸泡温度在15～35 ℃，浸泡时间对桑叶GABA含量的影响.

图2 浸泡温度对桑叶GABA含量的影响

从图2可知，桑叶GABA含量随着浸泡温度的升高先增加后减少.在15～25 ℃区间内，桑叶中GABA含量逐渐增加，达到最高点为2.84 mg/g.在一定的范围内，温度的升高促使细胞Ca2+浓度增加进而加快桑叶中GABA合成酶的反应速率，促使GABA积累[13].但温度过高会破坏谷氨酸脱羧酶的三级结构，从而导致酶活性降低，GABA含量下降[14].研究中，确定温度25 ℃为桑叶浸泡富集GABA的最佳温度.

2.1.3 浸泡时间对桑叶GABA富集的影响

控制谷氨酸钠浓度为3 g/L，浸泡温度为30 ℃，考察浸泡时间在5～25 h时对桑叶GABA含量的影响.从图3可知，不同的浸泡时间对桑叶中GABA的积累量有显著的差别，在5～15 h浸泡过程中，桑叶不断吸收谷氨酸钠，为GABA支路提供了充足的底物准备，同时在浸泡过程中形成的低氧环境有利于GAD等酶的激活，因此随着浸泡时间的延长，GABA含量逐渐上升.当浸泡时间超过15 h后，随着处理时间的延长桑叶中GABA含量明显降低.可能的原因是在浸泡过程中，桑叶长期处于低氧条件，丙酮酸和乳酸等代谢产物不断增加，致使溶液pH值逐渐降低，抑制GAD等酶的催化活性，降低GABA含量.因此，选择浸泡15 h为桑叶富集GABA的适宜时间.

图3 浸泡时间对桑叶GABA含量的影响

2.2 响应曲面优化实验

2.2.1 响应曲面实验结果

以浸泡时间(A)、浸泡温度(B)、谷氨酸钠浓度(C)为自变量，以桑叶GABA含量为响应值(Y)，进行响应曲面分析实验，结果如表2.

表2 响应曲面实验方案与结果

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析

根据响应面设计实验的结果，得到回归方程如下：

Y=4.24-0.34A+0.026B+0.11C+0.061AB-0.035AC+0.13BC-1.27A2-0.3 3B2-0.50C2.

由表3可知，回归方程模型P值<0.01，表明该模型是极显著的，因变量与自变量之间具有显著的关系.并且失拟项是不显著的(P>0.05)，拟合度良好，说明该模型选择正确[15].此模型的相关系数为0.975 4，说明该模型与实验拟合较好，可以用此模型进行预测和分析.因此能用此模型和回归方程确定富集桑叶GABA的最佳工艺.表3可以看出，模型中二次项均达到显著水平，而一次项中仅有浸泡时间(A)对桑叶GABA含量影响显著，其他一次项浸泡温度(B)、谷氨酸钠浓度(C)和交互项对桑叶GABA积累影响均不显著.从各个因素的显著性差异水平来看，各因素对桑叶GABA积累的影响依次为A(时间)>C(谷氨酸钠浓度)>B(温度).

2.2.3 响应曲面分析

由回归方程得出响应曲面和等高线，根据响应曲面的3D图形和等高线的形状分析各因素对桑叶GABA含量的影响.由表3和图4可以看出，AB和BC的交互作用对桑叶GABA含量的影响较明显，等高线图呈现密集的椭圆形，由此也说明AB和BC的之间具有一定的交互作用，这与方差分析结果相一致.此外，三因素中两者交互作用围成的椭圆形的等高线中心存在最小椭圆，则表明响应值(桑叶GABA含量)在3个因子设计的范围存在最大值[16].

表3 回归模型与方差分析

图4 三因素的交互作用对桑叶GABA含量影响的等高线和响应面图

2.2.4 桑叶GABA最佳富集工艺及结果验证

由软件Design-Expert 8.0.6预测桑叶GABA含量，得出最佳富集工艺条件为：浸泡时间18 h、浸泡温度25 ℃、谷氨酸钠浓度6.22 g/L,得到GABA含量为3.81 mg/g.为检验方法的可靠性，按上述优化条件进行桑叶GABA富集，实际测得桑叶中GABA含量为3.77 mg/g，与理论值无明显差异.

3 讨论

浸泡促使植物组织中GABA含量的增加可能有两种原因：一方面植物在胁迫环境下，细胞质Ca2+浓度增加，进而影响GAD活性[3].有研究结果表明，增加Ca2+浓度能够刺激谷物中GAD的活性，从而促进GABA合成[17].另一方面是浸泡处理提供了缺氧环境.植物为了抵抗不良环境胁迫，多胺物质含量会增加，提高二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性[18].文献[19]研究发现，鲜茶叶在缺氧条件下，腐胺和精胺含量得到显著提升，与GAD和DAO活性的升高趋势基本一致.实验采用谷氨酸钠浸泡法富集桑叶中GABA，其含量为普通桑叶的6.28倍，得到了显著提升，这与文献[4]在茶叶中富集GABA含量所达到的效果类似，但其具体累积机制尚未见文献报道，有待进一步研究.桑叶是药食两用植物资源，具有降血糖功能[20]，桑叶茶、桑叶粉等各种桑叶食品及原料越来越受到消费者的青睐.富集了GABA的桑叶可具有降血压、改善睡眠等多种功能[10,21]，为桑叶食品的开发提供实验依据.

4 结论

实验探讨了不同浸泡条件对桑叶GABA积累量的影响，通过单因素和响应曲面分析建立了浸泡法富集桑叶GABA模型，并得到最佳富集工艺，即浸泡时间18 h、浸泡温度25 ℃、谷氨酸钠浓度6.22 g/L，该条件下桑叶GABA含量为3.77 mg/g，为未处理桑叶中GABA含量(0.60 mg/g)的6.28倍，显著提高了GABA含量.在浸泡过程中，浸泡时间对桑叶 GABA含量影响最大.