甜菜应答盐胁迫PUB基因的生物信息学分析

王 爽，李海英

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

蛋白质作为生命的物质基础，需要保证其正常合成以及及时的降解。蛋白质稳态的保持与泛素蛋白酶体途径(ubiquitn proteasome system，UPS)密切相关[1]。在UPS中，由3种泛素化酶介导的级联反应对靶蛋白进行修饰。这个系统从泛素分子开始，首先E1泛素激活酶激活泛素分子并转移至E2泛素藕合酶上，E2负责将泛素分子通过E3泛素连接酶转移至靶蛋白上，完成泛素化修饰过程[2]。通常来说，特定的E2与E3的配对确定泛素化的类型，从而赋予底物不同的命运。然而在此过程中E3起到特异性识别底物的作用，由于其功能的重要性使E3成为研究热点。

植物中大部分U-box型蛋白(plant U-box protein，PUB)具有E3泛素连接酶活性，在UPS中扮演着重要的角色。据报道，在酵母和人类基因组中分别鉴定出2个和21个U-box型蛋白，而在拟南芥、水稻及大豆基因组中分别鉴定出64个、77个、125个U-box型蛋白[3-4]。植物中U-box型增加的数量表明这些蛋白可能在调节植物生长和发育过程中发挥作用。U-box型蛋白具有高度保守的约70个氨基酸序列，形成β-β-α-β折叠结构，暴露出促进E2与泛素分子结合的芳香族氨基酸残基和疏水氨基酸残基[5]。U-box蛋白被认为是修饰的RING蛋白，但与RING蛋白不同，U-box蛋白通过盐桥或氢键传递泛素分子。除了含有U-box结构域，PUB蛋白往往包含其他结构域，例如ARM基序、激酶结构域、WD40结构域、MIF4G基序等，基于这一点，可以对PUB蛋白进行再次分类[6-7]。

盐胁迫作为影响植物生长发育的重要的环境胁迫，可造成细胞内外Na+/K+离子不平衡、光合速率降低、细胞损伤甚至死亡[8]。研究表明，U-box基因家族作为重要的E3泛素连接酶家族，在植物应答非生物胁迫过程扮演着重要角色。拟南芥PUB18和PUB19转录水平可受盐胁迫诱导，与野生型植株相比，pub18pub19双突变株对盐胁迫的抗性增加[9]。拟南芥PUB22和PUB23可以泛素化RPN12a，从而在干旱胁迫反应中起作用[10]。小麦中TaPUB1可以与甘露糖苷酶蛋白(TAMP)相互作用，在植物响应盐胁迫反应过程中起到正向调控作用[11]。

甜菜作为中国重要的糖料作物，具有较强的耐盐能力。目前还没有关于甜菜PUB蛋白的相关报道。本实验利用前期得到的盐胁迫下甜菜转录组数据，从中筛选得到42个编码包含U-box结构域蛋白的差异表达基因。本研究对这些差异表达基因进行生物信息学分析，为深入研究甜菜PUB基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

二倍体栽培甜菜T710-Mu品系。

1.2 甜菜PUB蛋白的确定

实验室前期利用280 mmol/L NaCl[12]处理甜菜T710-Mu品系，得到盐处理条件下的甜菜T710-Mu品系叶片转录组数据[13]，从中筛选差异表达的PUB基因，得到42个差异表达的甜菜PUB基因，根据蛋白在转录组数据中的出现顺序将甜菜PUB蛋白命名为BvPUB1-BvPUB42，进行接下来的生物信息学分析。

1.3 甜菜PUB蛋白理化性质检测

该研究通过在PROTPARAM网站(https://web.expasy.org/protparam/)中输入PUB蛋白质的氨基酸序列，选择计算参数，分别对PUB蛋白质的氨基酸大小、分子量及等电点进行预测及分析。

1.4 基因在染色体上的分布

利用NCBI数据库获取甜菜PUB基因在染色体上的位置，并使用TBtools绘制染色体定位图。

1.5 PUB基因及保守结构域分析

利用NCBI数据库和TAIR拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)分别获得甜菜PUB蛋白质的氨基酸序列和拟南芥同源蛋白质的氨基酸序列，利用Pfam网站(http://pfam.xfam.org/)以及MEME在线软件(https://meme-suite.org/)对甜菜PUB蛋白的结构域进行分析，下载结果。在NCBI上查找甜菜(Beta vulgaris L.)的GFF3文件，使用MEGA-X软件并选用邻位相连法构建系统发育树。使用TBtools本地软件对PUB进行基因结构分析，并将基因结构和保守结构域可视化。

1.6 甜菜PUB蛋白的网络互作预测

利用STRING网站(https://string-db.org/)预测甜菜PUB蛋白的互作蛋白，绘制PPI，利用Cytoscape软件进行美化。

2 结果与分析

2.1 PUB基因的鉴定与分析

对在盐胁迫条件下差异表达的42个PUB基因序列进行分析（表1）。结果表明，它们编码的蛋白质长度介于245～1034 aa之间，预测分子量介于27885.88～96138.82 Da之间，等电点介于5.02～8.59之间。

表1 甜菜PUB基因的详细信息

2.2 染色体定位分析

利用基因位置信息以及Tbtools软件绘制甜菜PUB基因的染色体定位图（图2），通过定位图可以看出，42个甜菜PUB基因在9条染色体上均有定位，其中和chr1和chr2上包含较多的PUB基因，chr3、chr4和chr8上只包含1个PUB基因。

图1 甜菜PUB基因染色体定位示意图

2.3 PUB基因序列分析及保守结构域分析

利用甜菜PUB基因序列构建系统进化树，并结合甜菜基因组注释文件对甜菜PUB基因序列进行分析，绘制保守基序示意图（图2b）和基因结构示意图（图2c）。结果显示，PUB基因包含多个保守的motif，保守的motif构成的保守的结构域对于赋予PUB蛋白不同的生物学功能具有重要作用。这些保守的结构域主要包括U-box结构域，Pkinase结构域、Pkinase-Tyr结构域、Usp结构域、Arm结构域以及KAP结构域。基因序列分析结果显示，不同的PUB基因之间包含内含子与外显子个数存在差异。

图2 PUB基因结构分析

2.4 序列比对及分类

根据蛋白质的结构特征和系统进化树比较，将拟南芥中PUB蛋白分为7类。以拟南芥PUB蛋白分类为依据，对甜菜PUB蛋白进行分类分析，构建系统发育进化树（图3）。结果显示，甜菜PUB蛋白位于ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ类型中，说明这42个甜菜PUB蛋白与拟南芥的ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ类型PUB蛋白结构更相近。这为进一步研究甜菜PUB蛋白家族提供一定基础。利用MEME在线网站对甜菜PUB蛋白的保守基序进行分析（图4），结果显示甜菜PUB蛋白包含保守的约70个氨基酸组成的U-box型结构域（图5）。

图3 系统发育进化树

图4 PUB蛋白保守基序示意图

图5 U-box保守结构域示意图

2.5 甜菜PUB蛋白互作网络

利用STRING网站，将甜菜PUB蛋白与拟南芥蛋白进行比对并绘制PPI。结果显示，BvPUB5、BvPUB18、BvPUB 34、BvPUB 35分 别 与 拟 南 芥PUB13(63.7%)、PUB19(43.1%)、AT3G01400(75.7%)、AT3G49810(64.2%)有较高的同源性，并且它们之间具有互作关系。PUB13与Ras相关蛋白RABA4b存在相互作用关系，RABA4b属于Rab家族中的小GTPase亚家族，是一种调节膜转运的蛋白质。AT3G49810可以与BKI1相互作用，BKI1是一种质膜定位的磷蛋白质，可以直接与BRI1的激酶域相互作用从而抑制激酶活性。PUB19可以与26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11同源物ATS9相互作用，同时ATS9又与26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基RPN1A和RPN1B相互作用。这些结果说明甜菜PUB蛋白可能作为E3泛素连接酶对不同种蛋白质进行泛素化修饰，也可与26S蛋白酶体相互作用导致泛素化蛋白质降解。

3 讨论

植物生长和发育依赖于植物感知和响应环境及内源信号的能力，因此对植物的适当刺激和适当响应之间的相互作用十分复杂。除了信号传输外，信号转导途径本身的调节也很重要[14]。泛素介导的蛋白水解作为重要的翻译后过程在响应发育或适应环境胁迫的真核信号传导途径的调节过程中起到重要作用。蛋白质泛素化通过调节各种肽丰度、酶活性或蛋白质定位从而在植株生长发育的各个阶段以及抵抗各种生物胁迫和非生物胁迫过程中起关键作用[15]。E3泛素连接酶作为泛素化修饰过程中重要的酶，在植物响应非生物胁迫中起到重要作用。U-box型E3泛素连接酶小麦中TaPUB1通过调控干旱胁迫相关基因的表达，提高转基因植株对干旱的耐受性。除此之外，可促进TaPYL4和TaABI5的降解，降低转基因小麦对ABA的敏感性[16-17]。盐胁迫下，TaPUB26影响某些抗氧化酶基因的转录表达，破坏细胞的抗氧化酶系统，降低转基因植株的耐盐性[18]。在盐胁迫下上调表达，AtPUB30作为植物E3泛素连接酶可泛素化BKI1并导致其降解，从而负调控植株的耐盐性[19]。然而AtPUB31在植株响应盐胁迫过程中起到正向调控的作用[20]。本研究以前期转录组数据作为基础从中筛选盐胁迫下差异表达的甜菜PUB基因，并对其进行生物信息学分析，为接下来进行U-box型泛素连接酶的研究提供了更充分的理论基础及参考。此外，对U-box型蛋白的互作蛋白进行预测，26S蛋白酶体亚基相关蛋白、膜转运相关蛋白、激酶等功能蛋白被预测到，虽然结果仅为预测结果，但与已经报道的植物PUB蛋白存在一定相似性，所以结果可信，可作为后续互作蛋白鉴定的候选蛋白。

4 结论

本研究以甜菜T710-Mu品系为研究对象，利用转录组测序数据获得42个差异表达的PUB基因，对其进行生物信息学分析。发现甜菜PUB基因在甜菜9条染色体上均有定位，依据蛋白结构可将甜菜PUB蛋白归为ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ中，它们具有保守的功能结构域，如U-box，Pkinase、Pkinase-Tyr、Usp、Arm以及KAP结构域，可能是潜在的E3泛素连接酶。这些结果可为接下来研究甜菜U-box型E3泛素连接酶提供理论支持。

图6 甜菜PUB蛋白互作网络图