基于分子蒸馏技术紫苏油α-亚麻酸纯化效果的研究

刘 明，唐佳文，沙 爽，孟剑侠，程丽，李冲伟

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150080；2黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080）

0 引言

α-亚麻酸(α-Linolenic acid，ALA)是人体神经细胞[1-2]和大脑发育不可缺少的重要组成成分——二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前体物质[3]，具有保护心肌损伤、控制胆固醇水平，减轻非酒精脂肪肝症状等许多重要生理作用[4]，特别是DHA，俗称“脑黄金”，是大脑和视神经细胞的主要组成成分，能显著提高婴幼儿心理发育水平，对婴幼儿神经功能发育也有调节作用[5-6]。近几年，随着世界各国学者对α-亚麻酸研究的不断深入，对α-亚麻酸纯度和安全性提出了更高的要求，因此，获取绿色天然高纯度α-亚麻酸成为该研究领域的必然需求。

要获得高纯度α-亚麻酸，首先要把α-亚麻酸从植物中提取出来。目前，常用的提取方法有索氏抽提法[7-8]、冷榨法[9-10]、热榨法[11-12]、超临界 CO2萃取法[13-14]和水酶法[15-16]。这些提取方法各有利弊，通常根据不同的实验目的选择不同的提取方法。寻找高效的α-亚麻酸纯化方法一直是国内外学者关注的热点问题。Lee等[17]利用低温尿素包合法从紫苏油中纯化α-亚麻酸，其最佳条件下α-亚麻酸纯度为81.75%，但该法存在有机试剂残留问题；Wang等[18]探究了尿素包合与β-环糊精的4种不同组合方法对蚕蛹油中α-亚麻酸的富集效果，结果表明尿素与β-环糊精的组合效果最佳，纯度为67.4%；雍梁敏等[19]运用冷冻结晶法从橡胶籽油中提取纯化α-亚麻酸，含量为45.41%，纯化效率较低；陈新新等[20]通过银离子络合萃取和尿素包合相耦合的方式从紫苏油中提取纯化α-亚麻酸，纯度能达到99.08%，但偶合法对操作技术要求高，且生产成本消耗大。分子蒸馏技术是近十几年发展起来的非均相系分离方法，可提取纯化维生素E[21]、不饱和脂肪酸[22]、香精和香料[23]等易挥发或热敏性物质，脱除食品中的有害物质，如：苯并芘、塑化剂以及不良风味物质[24-25]。至今尚未发现使用分子蒸馏技术纯化紫苏油α-亚麻酸的相关报道。本文通过油脂评价指标筛选了紫苏油α-亚麻酸的提取方法，考察蒸馏温度、蒸馏压力、刮板转速和进料速度4个因素对分子蒸馏技术纯化α-亚麻酸效果的影响，从而探讨分子蒸馏技术纯化α-亚麻酸的可行性，为高纯度α-亚麻酸的生产提供新的理论方法和实践依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

紫苏籽，购自黑龙江桦南农盛园食品有限公司；α-亚麻酸标准品，购自北京百奥莱博科技有限公司，纯度≥98%，20 mg/支。试验在黑龙江大学教育部农业微生物技术工程中心，于2019年4—6月份进行。

1.2 主要仪器与设备

VKL70-5S标准型分子蒸馏装置，德国瑞达有限公司生产；7890A气相色谱仪器，美国Agilent公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 紫苏籽油提取方法的筛选 以获取高质量α-亚麻酸为目的，分别利用索氏抽提法、冷榨法、热榨法和超临界CO2萃取法提取紫苏油，选择提取率、碘价、酸值、皂化值和折光率5项指标，对油脂的不饱和水平、游离脂肪酸或酸败水平以及油脂的纯度进行评估，确定紫苏油提取的最佳方法。

（1）提取率的测定方法

按公式(1)计算提取率，每个实验重复3次。

式中：m1——紫苏油质量，g：m2——紫苏籽质量，g。

（2）碘价的测定方法

称取0.10～0.50 g紫苏油样品，加20 mL乙酸和环乙烷等比例混合溶液和25 mL乙酸溶液（含一氯化碘），在黑暗不透光处放置2 h。同时，空白对照不加入紫苏油样品。避光反应结束后，向锥形瓶中加入KI溶液，以Na2S2O3作为标准滴定液，每个实验重复3次。

碘值的计算见公式(2)。

式中：C——Na2S2O3标准滴定液浓度，mol/L：V0——空白试验组消耗Na2S2O3标准滴定液的体积，mL；V1——样品消耗Na2S2O3标准滴定液的体积，mL；m——油品质量，g。

（3）酸值的测定

称取5.0 g紫苏油样品于100 mL锥形瓶，加入30 mL 95%乙醇，震荡提取1 h。提取液转移至50 mL康宁管中，2000 r/min离心5 min，从上清液中取20 mL于锥形瓶中，加入3～4滴酚酞溶液，以0.01 mol/L的氢氧化钾-乙醇滴定液滴定至微红色，且保持30 s不褪色，记下氢氧化钾-乙醇滴定液的消耗量。以95%乙醇作空白对照，每个实验重复3次。

样品酸值(S)的计算见公式(3)。

式中：S——样品酸值，mg/100g；V0——空白试样消耗的氢氧化钾-乙醇滴定液体积，mL；V1——样品消耗氢氧化钾-乙醇滴定液体积，mL；C——氢氧化钾-乙醇滴定液浓度，mol/L；m——油品质量，g；ω——每百克原料中水分含量，g。

（4）皂化值的测定

在锥形瓶放入2 g油品，加入5粒沸石和25.0 mL氢氧化钾-乙醇溶液，连接好装置后煮沸，持续沸腾1 h后向其中添入3～4滴酚酞，以HCL作为标准滴定液，每个实验重复3次。

皂化值的计算见公式(4)。

式中：V0——空白试样消耗HCl标准滴定液的体积，mL；V1——样品消耗的HCl标准滴定液的体积，mL；C——HCl标准滴定液的浓度，mol/L；m——油品质量，g。

（5）折光率的测定

首先用二级水校正折光仪，在棱镜上滴两滴样品，之后将棱镜合上并旋紧，调节反光镜、补偿棱镜旋钮，再调节棱镜组旋钮，最后得到折光率值，每个实验重复3次。

1.3.2α-亚麻酸测定方法 称取0.5 g紫苏油于25 mL容量瓶中，加5 mL正己烷进行溶解，溶解后定容，手动摇匀。取2.0 mL上述溶液至10 mL指形瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液2.0 mL，混合振荡5 min，静置5 min，加入6 mL超纯水定容，上下颠倒混匀30 s，静置，保留下层溶液，用超纯水少量、多次进行洗涤，直至中性，保留正己烷层，过滤后上机。

气相色谱条件：色谱柱：HP-INNOWAX，柱温180℃，检测器温度230℃，程序升温：初始温度100℃，保持13 min，100～180℃，10℃/min，保持 20 min，180～200℃，1℃/min，保持20 min，200～230℃，4℃/min，保持10.5 min；进样量1.0 μL。采用面积归一法确定α-亚麻酸相对百分含量。

1.3.3 基于分子蒸馏技术α-亚麻酸纯化条件优化

（1）进料速度对α-亚麻酸纯度的影响

在蒸馏温度200℃、蒸馏压力0.05 mbar、刮板转速375 r/min条件下，考察0.5、1.0、1.5、2、2.5 d/min不同进料速度对α-亚麻酸纯度的影响，每个样品重复3次[26]。

（2）蒸馏温度对α-亚麻酸纯度的影响

在进料速度1.0 d/min、蒸馏压力0.05 mbar、刮板转速375 r/min条件下，考察180、190、200、210、220℃不同蒸馏温度对α-亚麻酸纯度的影响，每个样品重复3次。

（3）蒸馏压力对α-亚麻酸纯度的影响

在蒸馏温度200℃、进料速度1.0 d/min、刮板转速375 r/min条件下，考察0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mbar不同蒸馏压力对α-亚麻酸纯度的影响，每个样品重复3次。

（4）刮板转速对α-亚麻酸纯度的影响

在蒸馏温度200℃、蒸馏压力0.05 mbar、进料速度1.0 d/min条件下，考察325、350、375、400、425 r/min不同刮板转速对α-亚麻酸纯度的影响，每个样品重复3次。

（5）α-亚麻酸纯化的正交试验

在单因素试验基础上，设定蒸馏温度、蒸馏压力、刮板转速和进料速度4个因素，每个因素3个水平，采用L9(34)的正交试验方法，优化α-亚麻酸的纯化条件，正交试验设计如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

1.4 数据统计分析

利用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析，利用t检验法进行差异显著性分析，以P<0.05临界值表征两组数据间具有显著差异。

2 结果与分析

利用索氏抽提法、冷榨法、热榨法、超临界CO2萃取法提取紫苏籽油，测定紫苏籽油的碘值、酸值、皂化值、折光率，计算提取率和α-亚麻酸纯度，结果如表2所示，索氏抽提法的提取率和酸值均显著高于其他3种提取方法(P<0.05)，超临界CO2萃取法提取油脂的碘值、皂化值以及α-亚麻酸纯度3项指标的检测结果均显著高于其他3种提取方法(P<0.05)，折光率指标与冷榨法和索氏抽提法无显著差异(P>0.05)。综合比较分析，采用超临界CO2萃取法提取紫苏油。

表2 不同提取方法紫苏籽油各项指标

2.1 分子蒸馏技术纯化α-亚麻酸最佳工艺的确定

2.1.1 进料速度对α-亚麻酸纯度的影响 在蒸馏温度200℃、蒸馏压力0.05 mbar、刮板转速375 r/min条件下，考察进料速度对α-亚麻酸纯度的影响。结果如图1所示，在进料速度1.0 d/min时，α-亚麻酸纯度最高，随着进料速度提高，α-亚麻酸纯度开始降低，因此，进料速度选择1.0 d/min。

图1 进料速度对α-亚麻酸纯度的影响

2.1.2 蒸馏温度对α-亚麻酸纯度的影响 在进料速度1.0 d/min、蒸馏压力0.05 mbar、刮板转速375 r/min条件下，考察蒸馏温度对α-亚麻酸纯度的影响。结果如图2所示，在蒸馏温度210℃时，α-亚麻酸纯度明显高于其他组，因此，蒸馏温度选择210℃。

图2 蒸馏温度对α-亚麻酸纯度的影响

2.1.3 蒸馏压力对α-亚麻酸纯度的影响 在蒸馏温度200℃、进料速度1.0 d/min、刮板转速375 r/min条件下，考察蒸馏压力对α-亚麻酸纯度的影响。结果如图3所示，在蒸馏压力0.06 mbar，α-亚麻酸纯度达到最大值，因此，蒸馏压力选择0.06 mbar。

图3 蒸馏压力对α-亚麻酸纯度的影响

2.1.4 刮板转速对α-亚麻酸纯度的影响 在蒸馏温度200℃、蒸馏压力0.05 mbar、进料速度1.0 d/min条件下，考察刮板转速对α-亚麻酸纯度的影响。结果如图4所示，在刮板转速400 r/min时，α-亚麻酸纯度达到最大值。因此，刮板转速选择400 r/min。

图4 刮板转速对α-亚麻酸纯度的影响

2.1.5α-亚麻酸纯化正交试验结果 在单因素试验的基础上，设计4因素3水平正交试验，对各参数条件进行整体优化，结果如表3所示。

由表3和4可知，α-亚麻酸提取纯化过程中，4个单因素对α-亚麻酸纯度影响的大小为A蒸馏温度>B蒸馏压力>D进料速度>C刮板转速，其中A和B效果极显著(P<0.01)，D效果显著(P<0.05)。通过比较k值，确定最优组合A3B3C1D2，即蒸馏温度220℃，蒸馏压力0.07 mbar，刮板转速 375 r/min，进料速度 1.0 d/min。验证实验结果显示，α-亚麻酸纯度为97.42%。因此，A3B3C1D2为高纯度α-亚麻酸的最佳纯化条件。

表3 α-亚麻酸纯化正交试验分析表

表4 α-亚麻酸纯化正交试验方差分析

3 讨论

本试验比较了索氏抽提法、冷榨法、热榨法和超临界CO2萃取法提取紫苏油的提取率、碘值、酸值和折光率，结果表明，索氏抽提法的提取率和酸值均显著高于其他3种提取方法(P<0.05)，酸值高说明紫苏油中游离脂肪酸的含量高或酸败程度大，不利于后续α-亚麻酸的提取。超临界CO2萃取法提取油脂的碘值、皂化值以及α-亚麻酸纯度均显著高于其他3种提取方法(P<0.05)，折光率（除热榨法外）无显著差异(P>0.05)，尽管提取率相对低一些，但其他指标更好，且无有机溶剂残留。因此，综合比较，采用超临界CO2萃取法提取紫苏油。桂静芬等[27]利用响应面法对冷榨法提取紫苏油的工艺进行优化，最佳条件下紫苏油得率为34.28%，与本实验结果基本一致。Jung等[28]实验表明，紫苏籽油的提取率，正己烷(41.76%)>超临界CO2萃取法(39.56%)>机械压榨法(31.74%)，超临界CO2萃取法的提取率高于本实验结果，与有机溶剂法相当。王羚等[29]通过比较超临界CO2萃取法和有机试剂法提取的油茶饼中油脂的酸价、过氧化值、皂化值等指标，证明超临界CO2萃取油脂品质更好，与本试验结论一致。与前人结果对比可知，将紫苏籽进行适当预处理，如：烘烤和超声波破碎，或许可以提高油脂的提取率，超临界CO2萃取法提取工艺还有待进一步优化。

本试验以蒸馏温度、蒸馏压力、刮板转速和进料速度为考察因素，通过正交试验优化分子蒸馏技术的纯化效果。结果表明，最佳条件下α-亚麻酸纯度达到97.42%，分子蒸馏技术提取紫苏油中α-亚麻酸的效果还是相当不错。陈乐清[30]等利用分子蒸馏技术纯化亚麻籽油中α-亚麻酸，以预热温度、蒸馏温度、进料速度和刮板转速为优化因素，最佳条件下α-亚麻酸纯度为80.27%。刘金菊[31]等利用分子蒸馏技术纯化亚麻籽油α-亚麻酸，以蒸馏压力、蒸馏温度、刮板转速和进料速度为优化因素，最佳条件下α-亚麻酸纯度81.15%。根据以上结果推测，α-亚麻酸的原料来源和提取工艺对纯化结果影响也较大。

除了分子蒸馏技术之外，α-亚麻酸纯化方法还可以有很多，例如：刘旭等[32]利用尿素包合法从紫苏油中纯化α-亚麻酸，最佳条件下纯度达到77.23%。徐春明等[33]利用β-环糊精包和法纯化α-亚麻酸，最佳条件下纯度达到77.42%。相比较而言，分子蒸馏技术得到的α-亚麻酸纯度更高。

4 结论

结合α-亚麻酸纯度和安全性考虑，最终采用超临界CO2萃取法提取紫苏油，并以此作为分子蒸馏的原料。通过单因素试验和正交试验，确定了基于分子蒸馏技术紫苏油α-亚麻酸纯化的最佳工艺为：蒸馏温度220℃，蒸馏压力0.07 mbar，刮板转速375 r/min，进料速度1.0 d/min，在此条件下α-亚麻酸纯度为97.42%，这表明分子蒸馏技术在获取高纯度α-亚麻酸方面具有研究意义。未来的研究中，可对紫苏籽进行适当的预处理，在保证油品质量的前提下，进一步提升紫苏油的提取率。

紫苏籽含有45%～50%紫苏油，紫苏油含有60%～65%α-亚麻酸，利用超临界萃取技术和分子蒸馏技术，不仅能够获得高纯度α-亚麻酸，而且α-亚麻酸质量好，安全无污染。随着人们生活质量和健康水平的不断提高，α-亚麻酸的需求量和质量逐步上升。因此，采用分子蒸馏技术获取绿色天然高纯度α-亚麻酸的方法具有广阔的市场应用前景。