沈阳地区猪源性奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

王一，张妍妍

摘要：从沈阳某猪场分离得到一种革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、短小杆菌，纯化后经16S rRNA测序分析，初步确定分离菌为肠杆菌科变形杆菌属，经培养特性观察和生化试验确定为奇异变形杆菌。将分离菌接种于小鼠，小鼠24h内死亡，证实该菌具有一定的致病性。在此基础上进行药物敏感性试验，表明该菌对庆大霉素、环丙沙星较为敏感。本项研究结果为沈阳地区猪奇异变形杆菌病的诊断和治疗提供了理论依据。

关键词：猪;变形杆菌;分离鉴定;药敏试验

奇异变形杆菌（proteus mirabilis，PM）属于肠杆菌科变形杆菌属成员，变形杆菌属包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩氏变形杆菌、雷氏变形杆菌和无恒变形杆菌五个种，其中奇异变形杆菌致病性较为严重，广泛分布于泥土、水、粪便、以及人和动物的体表、黏膜及消化道，是一种常见的条件致病菌，其产生的毒素可引起中毒[1]。奇异变形杆菌能引起人和动物的尿道炎及肾盂肾炎，严重的能导致菌血症、败血症[2]。Bisgaard M等在1981年从患有输卵管炎蛋鸡的输卵管内分离出了奇异变形杆菌[3];江益民（1990）从有腹泻和呼吸道症状的病死鸡肝脏中分离出了奇异变形杆菌。叶树株（1991）在福建发现并报道了猪的奇异变形杆菌病，这是国内首次对猪奇异变形杆菌的报道;随后，徐春厚（1993）于黑龙江发现了该病，在之后的几年里没有猪奇异变形杆菌发病的报道，直至2008年变形杆菌的报道逐渐增多，四川、江苏、福建、湖北、广州[4～8]等地区也有报道。病猪以体温升高，精神沉郁，腹泻为主要临床症状。剖检可见病猪肺，肺门淋巴结、气管、小肠等有明显的病理变化[5]。

1材料与方法

1.1 材料

1）病料来源 沈阳某猪场2月龄仔猪发生体温升高，精神不振，咳嗽、腹泻、呼吸困难等症状，个别猪死亡，剖检可见肺充血出血，呈红色等，无菌采取肝脏3份，作为待检病料。

2）主要试剂  革兰氏染液、营养琼脂、麦康凯琼脂按常规方法配置、生化反应管购于杭州滨和微生物试剂有限公司、DNA试剂盒杭州博日科技有限公司、2×Taq酶、庆大霉素、环丙沙星、四环素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那等11种药敏试片物购自上海金穗生物科技有限公司。

3） 实验动物  选择体重为18g～22g的昆明小白鼠，共20只，雌雄兼有。

1.2 方法

1）细菌的分离与纯化 无菌条件下采取病猪的肝脏，分区划线于普通营养琼脂、麦康凯营养琼脂平板，37℃培养18～24h，将疑似菌纯化3代后观察细菌形态。

2） 细菌染色镜检 采用革兰氏染色对纯化后分离菌进行染色镜检，镜下观察其形态基本一致判定为纯化菌。

3） 16S rRNA扩增与测序 将分离菌接种于普通营养琼脂上培养至对数期，使用DNA提取试剂盒提取总DNA，取5μL作为PCR模板。扩增引物参考William GW[9]设计的引物：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492r：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'，预期产物大小约1500bp。反应体系：分离的细菌DNA模板5μL，2×Taq聚合酶15μL，引物上下游各1μL，ddH2O 8μL，共30μL;反应条件：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火55℃0.5min，延伸72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压为120V，电流100mA，35分钟后凝胶成像系统照相记录结果。获得预期产物后送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序，采用Blast在线比对分析。

4） 培养特性观察 将纯化后的菌接种于麦康凯、伊红美蓝、鲜血琼脂培养基25℃培养箱中培养24h观察细菌落形态。

5） 生化鉴定 参照伯杰氏细菌鉴定手册进行生化试验[10]。将纯化后的菌接种于13种生化微量反应管封口放于37℃培养箱中培养48h后，观察。

6）药敏试验 采用纸片琼脂扩散法测定该菌对常用抗生素的敏感性。测量所得抑菌圈直径，参照CSLI的抗菌药物敏感性试验解释标准[11]进行结果判定，敏感性判定标准（见表1）。

2 结果

2.1 病原分离与形态特征

在普通培养基上形成无色，半透明的扁平菌落，镜下观察细菌形态为革兰氏阴性小杆菌，呈現多形性，但杆状居多（见图1）。

2.2 16S rRNA扩增与测序分析

分离菌纯培养物利用16S rRNA通用引物27F、1492r进行PCR扩增，扩增出1500bp左右的特异性目的基因片段，与预期片段大小基本一致（如图2）。测序后获得有效序列1378bp，在NCBI数据库中采用Blast在线比对分析，SFI分离菌的16s rRNA基因序列与变形杆菌序列的同源性很高，相似性在100%以上的有21株，且均为变形杆菌属成员，由此可见分离菌为肠杆菌科变形杆菌属成员。

2.3培养特性

在麦康凯培养基上形成圆形（37℃），扁平，圆形，半透明菌落。（见图3）;在血琼脂上呈灰白色平铺并且有溶血现象;在伊红美兰琼脂上不生长。在麦康凯上25℃培养时有明显的迁徙性，呈波浪状（图4）。

2.4 生化鉴定结果

分离株蔗糖、木糖、枸橼酸盐、反应呈阳性;阿拉伯醇、赤藓醇、肌醇、麦芽糖、甘露醇、鸟氨酸脱羧酶、卫矛醇、乳糖反应呈阴性;发酵葡萄糖产酸产气;能产生H2S。参照伯杰氏细菌鉴定手册，符合奇异变形杆菌的生化特性（见表2）。

2.5 药敏试验结果

根据试验结果显示该株奇异变形杆菌对庆大霉素、环丙沙星敏感，对头孢喹肟为中敏，对链霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、妥布霉素、亚胺培南、氯霉素、万古霉素耐药（表3）。

2.6 致病性实验

接种变形杆菌菌悬液后24h内，小鼠全部死亡。剖检可见小鼠腹膜黄染，盲肠胀气并伴有恶臭，肝脏肿胀脆弱易碎（图5）。小鼠的心血接种均能分离到变形杆菌。对照组小鼠表现正常，无死亡。证明该菌对小鼠有致病性。

3讨论

奇异变形杆菌在目前我国公布的细菌性食物中毒病原谱中排名第四，是引起食物中毒主要病原之一[12]。近些年关于猪变形杆菌病发病的报道越来越多，本实验将临床出现体温升高，精神沉郁，腹泻的病猪剖检，获得一株细菌，该菌在临床症状，发病日龄，剖检变化与沙门氏菌发病十分相似，后经16s rRNA送检测序和生化实验确定为猪的奇异变形杆菌，在此基础上进行了致病性试验，药敏试验，为临床治疗提供理论依据。

参考文献：

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