高效液相色谱法测定双葛止泻口服液中葛根素的含量

朱华伟，周冰，李焕娟,李传栋，张聪，周德刚

摘要：本试验旨在建立双葛止泻口服液中葛根素的含量测定方法。试验用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm），以甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76）为流动相;检测波长为250nm;流速为1.0mL/min;柱温为30℃。结果表明，葛根素进样量在0.1616～1.6159μg的范围内线性关系良好（r=0.9999），回收率的平均值为100.5%，RSD为0.8%。因此，该方法准确度高、专属性好，可用于双葛止泻口服液中葛根素的质量控制。

关键词：双葛止泻口服液 ;葛根素;高效液相色谱法

双葛止泻口服液是由金银花、葛根、黄芩、黄连等中药组成，采用提取、纯化技术，加入适宜的辅料，灭菌而制成的口服液制剂。本方来源于《伤寒论》中的经典方剂“葛根芩连汤”，通过组方加减，工艺优化而制成的新型中兽药制剂，为农业农村部批准的国家三类新兽药（农业农村部公告 第186号）。本方具有清热燥湿，解毒止泻的功效，用于仔猪湿热泄泻。方中金银花清热解毒、疏散风热，葛根解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络，二者共为君药。研究表明，本品具有一定的抗炎止泻作用，其止泻机制与抑制胃肠运动具有相关性[1]，且本品对麻鸡大肠杆菌病具有良好的治疗效果[2]。方中金银花的化学成分主要为黄酮类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类和有机酸类等[3]，葛根的化学成分主要为葛根素、大豆苷元和大豆苷等异黄酮类化合物，香豆素类及三萜及三萜皂苷类成分，此外还有丰富的矿物质和氨基酸[4]。公司已建立该产品中指标成分绿原酸的含量测定方法[5]，为了更好地控制该产品的质量，本文采用高效液相色谱法，建立了本品中葛根素的含量测定方法，并对该方法进行了系统的方法学研究，以期为该制剂的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪（配2489型紫外检测器，美国Waters公司）;AB135-S型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.1.2 试药与试剂 葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110752-201514，含量：95.5%）;双葛止泻口服液（洛阳惠中兽药有限公司，批号：20170201，20170202，20170203，規格：0.45g生药/mL）;乙腈（HPLC级，Thermo Fisher Scientific公司）;磷酸（HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司）;水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）。流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76），流速：1.0mL/min;柱温：30℃;检测波长：250nm;进样量：10μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成每1mL含80μg的溶液，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品2mL，置100mL量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方制备缺葛根的阴性对照样品，按“.2.3”项下方法制成阴性对照溶液，即得。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1专属性。分别取“1.2.2”项下对照品溶液、“1.2.3”项下供试品溶液及“1.2.4”项下阴性对照溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按上述“1.2.1”项下的色谱条件，依法测定并记录色谱图。

1.2.5.2线性关系。取“1.2.2”项下对照品溶液，分别精密吸取2、5、10、15和20μL注入高效液相色谱仪，按上述“1.2.1”项下的色谱条件依法测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，葛根素的进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

1.2.5.3精密度。取“1.2.2”项下对照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件依法测定，连续进样6针，测定峰面积并计算RSD。

1.2.5.4重复性。取双葛止泻口服液样品（批号：20170201），平行6份，分别按照“1.2.3”项下的操作方法制备供试品溶液，并按上述“1.2.1”项下的色谱条件依法测定，记录峰面积并计算葛根素含量及RSD。

1.2.5.5溶液稳定性。取双葛止泻口服液（批号：20170201），按照"1.2.3"项下方法制备供试品溶液，分别于第0、2、4、8和12h进样，依法测定，记录峰面积并计算峰面积的RSD。

1.2.5.6加样回收率。精密称取葛根素对照品35.22mg，置25mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取已知含量的样品（批号：20170201，含量：4.0mg/mL）6份，每份1mL，置100mL量瓶中，各精密加入上述对照品储备液3mL，按照“1.2.3”项下制备供试品溶液，测定峰面积并计算含量，计算回收率、平均回收率及RSD。

1.2.6 耐用性 为了考察色谱条件发生小的变化时，葛根素含量测定结果受影响的程度，分别对流动相比例、柱温、流速及色谱柱型号等因素进行小的调整，记录葛根素含量的变化情况。按“1.2.2”和“1.2.3”项下方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，采用单因素考察法，每次调整其中一个因素，依法测定含量。记录每个因素下的峰面积，并计算葛根素含量及RSD。

1.2.7 样品测定 取双葛止泻口服液样品（批号为：20170201，20170202，20170203），按“1.2.3”项下的操作方法制备供试品溶液，按上述“1.2.1”项下的色谱条件依法测定，计算样品中葛根素的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性考察 按"1.2.5.1"项下进样分析，结果供试品色谱在与对照品色谱中葛根素主峰相同的位置，有保留时间一致的色谱峰。阴性对照色谱在与葛根素主峰相应的位置处无干扰。结果表明，本方法专属性良好。见图1。

2.1.2 线性关系考察 按“1.2.5.2”项下进样分析，记录峰面积，绘制标准曲线并计算回归方程及相关系数，回归方程为：Y=4765824.5939X-170324.1707（r=0.9999），表明葛根素进样量在0.1616～1.6159μg范围内，峰面积与进样量线性关系良好，结果见表1。

2.1.3 精密度试验 按“1.2.5.3”项下进样分析，连续进样6针，记录峰面积并计算峰面积的RSD，结果见表2，葛根素峰面积的RSD为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 按“1.2.5.4”项下进行操作，平行制备6份供试品溶液，依法测定，结果见表3，6份样品含量测定结果的RSD为1.1%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 溶液稳定性试验 按“1.2.5.5”项下进行操作，分别在第0、2、4、8和12h进样分析，计算峰面积的RSD。结果见表4，葛根素峰面积的RSD为0.8%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.1.6 加样回收率试验 按“1.2.5.6”项下进行操作，结果6份样品的回收率在99.73%～101.92%之间，平均回收率为100.5%，RSD为0.8%，表明该方法准确度良好。结果见表5。

2.2 耐用性

按照“1.2.6”项下的方法进行操作。结果表明，通过调整流动相比例、柱温、流速以及更换不同型号的色谱柱，各条件下葛根素含量测定结果均没有显著差异，RSD均符合要求。表明该色谱条件的耐用性良好。结果见表6。

2.3 樣品测定

按照“1.2”项下的操作方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，依法测定双葛止泻口服液三批样品中葛根素的含量，测定结果见表7。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用紫外-可见分光度法进行全波长扫描，结果葛根素在250nm处有最大吸收。参考《中国兽药典》2015年版一部[6]葛根药材含量测定项及相关文献报道[7，8]，葛根素的检测波长多采用250nm。综合分析，确定葛根素的检测波长选择250nm。

3.2 色谱条件的考察

曾参考《中国兽药典》2015年版一部葛根药材含量测定项，以甲醇-水（25：75）为流动相，结果该条件下葛根素主峰附近有多个杂峰，且与葛根素主峰分离度不好。根据相关文献[9，10]，通过在水相中加入磷酸，并对流动相比例进行优化，所得色谱峰峰形较好，阴性对照无干扰。通过不同流动相比例、柱温、流速、色谱柱的耐用性实验，葛根素含量均没有显著变化，表明本方法的耐用性较好。

本文建立了一种高效液相色谱法测定双葛止泻口服液中葛根素含量的方法，并对该方法进行了验证，结果该方法准确度高、专属性好，可用于该产品中葛根素的质量控制。

参考文献：

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