水陆地黄胶囊通过LKB1/AMPK/Sirt1信号通路调控糖尿病肾病大鼠足细胞自噬的实验研究

王惠玲 雷迪 赵思阳 司海龙

自噬是真核细胞在相关蛋白和基因调控下，通过溶酶体系统清除细胞中的非正常细胞器，是重要的细胞内降解机制[1]。当细胞受到各种刺激，如营养变化、代谢压力等改变时，自噬活性会极大提高[2]。正常情况下，细胞自噬有利于细胞保持自身稳态，防止有毒或损伤蛋白质和细胞器的累积，维持着细胞健康生理功能。当自噬被抑制时，细胞凋亡启动，可加速细胞死亡[3]。大量的研究证实肾脏足细胞自噬的异常与糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)的发病和进展密切相关[4]。Podocyte即肾小球脏层上皮细胞(glomerular epithelial cells，GEC)，是维持肾小球滤过屏障主要的细胞之一[5-6]。足细胞是高分化细胞，在人体中很难再分化，一旦损伤则不能再生，因此足细胞受损是DKD发病及进展的标志之一[7]。

近年来DKD发病率迅猛增长，成为终末期肾病(end stagerenal disease，ESRD)的最常见病因[8]。目前，DKD的治疗包括健康的生活方式、降糖药物、RAS抑制剂、免疫抑制剂使用等，上述治疗措施在DKD的某些阶段确可发挥部分作用，但其副作用不容忽视，且随病程推进依然不能阻止DKD进一步发展。中医药治疗DKD可延缓病情进展，疗效显著。水陆地黄胶囊以清代医家程国彭《医学心悟》的六味地黄汤为基础，陕西省名中医马居里教授将其加减化裁为生黄芪、熟地黄、山药、山萸肉、泽泻、茯苓、丹皮、丹参、芡实和金樱子十味药物，并命名为水陆地黄胶囊(该胶囊由六味地黄汤及水陆二仙丹组成，前期命名为糖肾一号胶囊，现改名为水陆地黄胶囊，较前期命名体现其药物组成)，该药具有益气养阴，活血化瘀之功效，临床上用于DKD的治疗并取得良好的疗效。前期研究发现，水陆地黄胶囊能有效降低DKD患者血清基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9、MMP-2水平，提高基质金属蛋白酶抑制剂-I(tissue inhibitor of metalloproteinase-I, TIMP-I)水平，减轻尿微量白蛋白，缓解临床症状，延缓肾脏纤维化[9]。本课题在前期研究基础上，观察水陆地黄胶囊是否可通过激活肝激酶B1/腺苷酸活化的蛋白激酶/沉默信息调节因子-1(LKB1/AMPK/Sirt1)信号通路调节足细胞自噬活性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠，雄性，体质量约200 g，SPF级，由三峡大学提供，许可证号为SCXK(鄂) 2016-0057。饲养于陕西中医药大学实验中心SPF级动物房，室温25℃，湿度70%,正常饮食。

1.2 药品及试剂

水陆地黄胶囊，药物组成：生黄芪30 g、熟地黄12 g、山药15 g、山萸肉12 g、茯苓15 g、泽泻15 g、丹皮12 g、丹参20 g、金樱子15 g、芡实15 g，每粒 0.5 g(含生药量13.4 g)，由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供；贝那普利(诺汀新)10 mg，批号：X3112，北京诺华制药有限公司。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，批号：S110910,阿拉丁；尿蛋白定量测试盒，批号：C035-2，南京建成；苏木素，批号：H9627，Sigma；伊红Y(水溶性)，批号：71014544，国药集团；包埋石蜡，批号：69019361，国药集团；中性树胶，批号：10004160，国药集团；丽春红S，批号：71033942，国药集团；酸性品红，批号：F8129，Sigma；磷钼酸，批号：20029916，国药集团；兔单抗LC3(14、16KD)，批号：83506，CST；兔多抗Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1,Beclin-1)(60 KD)，批号：11306-1-AP,武汉三鹰；兔多抗沉默信息调节因子-1(silent information regulator-1,Sirt1)(82KD)，批号：DF6033,Affinity；兔多抗肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)(65KD)，批号：AF6453,Affinity；兔多抗腺苷酶激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)(62KD)，批号：10929-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公司; 兔多抗P-AMPK(ser485)(62KD)，批号：4184,CST；兔多抗LC3(16/14KD)，批号：AF5402,Affinity。

1.3 仪器

FlexStation 3多功能酶标仪，Molecular Devices；病理切片机，德国Leica， RM 2016；脱水机，武汉俊杰，JT-12J；电脑生物组织脱水机切片刀，日本羽毛，R35；组织摊烤片机，武汉俊杰，JK-6；载玻片及盖玻片，江苏世泰实验器材有限公司；显微镜，奥林巴斯，BX53；透射电镜，日本HITACHI/美国FEI公司，HT7700-SS/FEI Tecnai G20 TWIN；电泳仪电源，北京六一仪器厂，DYY-7C；水平摇床，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-1；pH计，德国Metter-Toledo GmbH公司；LP115电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司，CPA；磁力搅拌器，江苏省金坛市中大仪器厂，T8-1。

1.4 实验动物造模及分组

60只SD雄性大鼠随机选取10只作为正常组(空白对照组)，对照组大鼠进食普通饲料，造模组50只大鼠给予高脂高糖饲料，4周后，造模组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(40 mg/kg)，3天后禁食12小时取尾静脉血，测空腹血糖≥6.7 mmol/L，确定为DKD大鼠造模成功[10]。其中，46只大鼠造模成功，4只血糖低于6.7 mmol，无死亡大鼠。将造模成功的DKD大鼠随机分为模型组、西药组(贝那普利组)、中药组(水陆地黄胶囊组)，各10只。正常组与模型组大鼠每日予以生理盐水3 mL灌胃，贝那普利组予以3 mL药液灌胃(0.85 mg·kg-1·d-1研磨溶于3 mL生理盐水)，水陆地黄胶囊组予以3 mL药液灌胃(6 g·kg-1·d-1研磨溶于3 mL生理盐水)，每天一次，固定时间，共计灌胃8周。灌胃结束留取腹主动脉血标本及24小时尿液标本，处死大鼠留取肾脏。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 DKD大鼠相关指标检测 取腹主动脉血标本及24小时尿液标本，生化分析仪检测空腹血糖、肌酐、尿素氮；严格按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿微量蛋白。

1.5.2 肾脏组织病理学观察 肾脏组织于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗后，修整组织置于包埋盒中，组织脱水，浸蜡，包埋，切片，烤片，切片脱蜡， HE染色、 Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。

1.5.3 透射电镜观察自噬泡的形成 取出固定完成的标本，0.1 M磷酸缓冲液漂洗3次，1%的锇酸、0.1 M磷酸缓冲液固定2小时，脱水，渗透，包埋，切片，染色，封片，电镜下观察足细胞的自噬小体。

1.5.4 Western blot检测肾脏组织Beclin-1、LC3-II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表达 将剪碎的组织块置于EP管中，加入去污剂裂解液裂解后匀浆，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性，制备电泳胶，电泳分离及一抗、二抗孵育，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 DKD大鼠相关指标检测

2.1.1 血糖 与正常组相比，给药8周后模型组、西药组、中药组的血糖进一步升高(P<0.05)；与模型组相比，中药组血糖下降，组间比较有统计学差异(P<0.05)，提示中药有一定的降糖功效。见表1。

表1 各实验组大鼠血糖比较

2.1.2 血肌酐、尿素氮 与正常组相比，模型组、西药组、中药组的血肌酐和尿素氮明显升高，组间比较有统计学差异(P<0.05)，提示造模成功；与模型组相比，西药组、中药组的血肌酐和尿素氮下降，组间比较有统计学差异(P<0.05)；与西药组相比，中药组血肌酐和尿素氮下降，但无统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 各实验组大鼠血清BUN、Scr比较

2.1.3 24小时尿微量白蛋白 与正常组相比，模型组、西药组、中药组24小时尿微量白蛋白明显升高，组间比较有统计学差异(P<0.05)，提示造模成功；与模型组相比，西药组、中药组的24小时尿微量白蛋白明显下降(P<0.05)；与西药组相比，中药组24小时尿蛋白下降，但无统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各实验组大鼠24小时尿蛋白定量比较

2.2 DKD大鼠肾脏组织病理学观察

2.2.1 HE染色 正常组大鼠肾脏组织细胞排列规则有序，肾小球、肾间质等形态结构大致正常；模型组可见细胞排列不规则，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞脱落，出现管型；西药组、中药组肾脏组织病变较模型组明显减轻，有少量炎性细胞浸润系膜增生。见图1。

注：A正常组；B模型组；C西药组；D中药组。

2.2.2 Masson染色 正常组大鼠肾脏组织细胞排列规则有序，肾小球、肾间质等形态结构正常；模型组出现大量纤维化；西药组、中药组肾脏组织病变较模型组明显减轻。见图2。

注：A正常组；B模型组；C西药组；D中药组。

2.3 观察DKD大鼠肾脏组织自噬泡的形成

正常组细胞内结构正常，可见明显自噬泡，模型组细胞结构破坏，自噬泡较少；与模型相比，中药组、西药组自噬泡增多，提示自噬增强。见图3。

注：A正常组；B模型组；C西药组；D中药组。

2.4 Western blot 检测肾脏组织Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表达

与模型组相比，中药组、西药组肾脏组织中Beclin-1表达均明显升高(P<0.05)，提示自噬启动；与模型组相比，中药组、西药组肾脏组织中的LC3II/I表达升高(P<0.05)，提示细胞自噬增强。与模型组相比，中药组、西药组肾脏组织中AMPK表达无明显差异(P>0.05)，而LKB1、p-AMPK、Sirt1蛋白的表达均明显升高(P<0.05)，提示该信号通路被激活。见图4，表4、5。

图4 各实验组大鼠肾脏组织Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表达

表4 各实验组大鼠Beclin-1、LC3II/I、LKB1蛋白表达比较

表5 各实验组大鼠AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白表达比较

3 讨论

自噬泡的形成是诊断自噬发生的金标准，借助于电子显微镜可以判定。目前医学界普遍认为Beclin-1是自噬发生的启动蛋白；LC3定位于自噬泡与自噬泡膜表面，当细胞未发生自噬时，LC3形成LC3-I，当细胞自噬启动时，LC3-I转化为LC3-II，结合到自噬体膜表面，因此LC3-II与LC3-I的比值可以定量描述自噬程度。综上，本实验所及的观察指标：自噬泡、Beclin-1、LC3-II/I可以客观地衡量自噬地发生与强度。Sirt1是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶，分别通过细胞内一磷酸腺苷(AMP)和 NAD+水平的增加而被激活，为 Sirtuins 家族成员之一。目前发现Sirt1介导自噬有两种方式，一方面是Sirt1使ATG和LC3脱乙酰化，导致自噬激活[11]；另一方面通过Sirt1-转录因子Foxo自噬通路，提高hVps34、ATG12和促凋亡蛋白Bnip3的表达[12]，参与自噬的正向调控。LKB1/AMPK/Sirt1信号通路作为Sirt1中正向调节通路，该信号通路活性的降低导致足细胞自噬受到抑制，对DKD的发生发展起到重大的推进作用。研究表明，足细胞特异性Sirt1缺失加重了糖尿病db/db小鼠的蛋白尿和足细胞损伤[13]；二甲双胍可以激活Sirt1和AMPK，防止高血糖引起的Sirt1蛋白水平降低，改善葡萄糖摄入足细胞，降低肾小球滤过屏障通透性[14]。中医药领域也有类似的研究，如研究发现中药益肾颗粒可能通过调节LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，减轻DKD大鼠肾脏病理改变[15]。上述的研究提示：一方面LKB1/AMPK/Sirt1信号通路在糖尿病肾病大鼠中起作用；另一方面LKB1/AMPK/Sirt1信号通路与自噬的发生也密切相关。本课题的特点在于将LKB1/AMPK/Sirt1信号通路与自噬现象结合起来研究，探讨它们之间的联系，结果也显示水陆地黄胶囊可通过调节LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，改善足细胞自噬和恢复肾小球滤过屏障功能。

马居里教授在DKD“气阴两虚，瘀血痹阻”病机理论基础上将水陆地黄胶囊长期应用到临床上，作为院内制剂用于治疗DKD，疗效显著。纵观此方，六味地黄汤滋补肾阴为基础方，生黄芪益气固表，丹参活血化瘀，二仙丹固摄肾气。诸药合用，共奏益气养阴，活血化瘀之功效。本研究结果表明：经过水陆地黄胶囊干预的中药组血糖明显下降，提示中药有一定的降糖功效，这也可能是中药干预DKD的基础。在这基础之上中药能进一步改善肾功能：表现在血肌酐和尿素氮下降，及尿蛋白的控制。HE染色、Masson 染色的结果显示：水陆地黄胶囊对肾脏正常结构的保护作用。电镜下观察自噬泡的形成结果提示自噬增强。Western blot 检测肾脏组织Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK/AMPK、Sirt1蛋白的表达，结果显示：水陆地黄胶囊通过LKB1/AMPK/Sirt1信号通路增强足细胞自噬活性。综上所述，水陆地黄胶囊能降低糖尿病肾病大鼠血糖，改善肌酐、尿素氮，减少尿蛋白，其机制可能是通过激活LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，进而增强足细胞自噬活性。