新生儿重度窒息后急性肾损伤尿细胞周期停滞标志物的 临床研究

颜崇兵 马 俐 张潇月 张红专 孙婧婧 沈云琳

上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院新生儿科(上海 200062)

新生儿窒息是指由于分娩过程中的各种原因使新生儿出生后不能建立正常呼吸，引起低氧血症、高碳酸血症、代谢性酸中毒，严重时可导致全身多脏器损害的一种病理生理状况[1]。由于新生儿肾血流量占心输出量少，对肾血流量的改变十分敏感，当新生儿窒息时可导致血流重新分布，极易发生急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）。目前AKI的诊断主要依靠血清肌酐和尿量，但是血清肌酐往往受到母亲因素的影响，而且新生儿AKI很少出现少尿，因此早期发现新生儿AKI比较困难。金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）和胰岛素样生长因子结合蛋白-7（insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）是两种重要的细胞周期停滞标志物。目前有研究认为，不论是对于心脏外科术后、成人内科患者，还是儿科患者，IGFBP7×TIMP-2（两种指标浓度相乘）均在早期明显增高，有较好的应用价值[2-6]，但尚未见该联合指标在新生儿AKI中的应用报道。本研究采用酶联免疫吸附法（ELISA）动态测定住院重度窒息新生儿尿中细胞周期停滞相关标志物TIMP-2 和IGFBP 7浓度变化情况，以了解IGFBP7×TIMP-2在重度窒息新生儿AKI中的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019 年1 月至2020 年6 月入住上海市儿童医院新生儿科的重度窒息新生儿作为研究对象，入选标准：①符合2016 年中华医学会围产医学分会新生儿复苏学组提出的新生儿重度窒息诊断标准[7]，即Apgar评分1分钟≤3分，或5分钟≤5分，伴脐动脉血 pH值＜7.0；②生后6 h内入院。排除标准：①出生体质量＜1 500 g；②有严重先天性畸形、先天性肾脏疾病、染色体异常、围生期感染、肿瘤、甲状腺疾病的患儿；③住院期间行连续性肾脏替代治疗；④母亲孕期及新生儿使用肾毒性药物。

本研究经上海市儿童医院伦理委员会审查通过，患儿家长签订知情同意书。

根据是否发生AKI，将入选重度窒息新生儿分为AKI组和非AKI组。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集研究对象的性别、胎龄、出生体质量、1分钟和5分钟Apgar评分等一般资料。

1.2.2 标本采集及检测 所有患儿于入院当时、生后24 h、48 h和1周留取新鲜尿液标本2～5 mL（采用一次性外置型集尿袋收集尿液，如因为各种原因留置导尿的则通过导尿管收集），离心后取上清液置-80 ℃ 冰箱保存，用于检测尿细胞周期停滞相关生物标志物TIMP-2 和IGFBP 7 水平的动态变化；同时各时间点分别留取血标本1 mL，离心后收集血清并置于-80 ℃冰箱保存，用于检测血清肌酐水平。尿液TIMP-2和IGFBP7的ELISA试剂盒均购自ABclonal公司，并严格按说明书操作。IGFBP7×TIMP-2为IGFBP7和TIMP-2两者浓度相乘再除以1000得出的结果。血清肌酐采用HITACHI 7180自动分析仪测定。所有患儿均记录尿量，以评估是否存在AKI。

1.2.3 新生儿AKI 诊断标准 根据全球改善肾脏病预后委员会（kidney disease:improving global outcome，KDIGO）发布的AKI 临床实践指南标准中新生儿AKI 的诊断标准[8]进行诊断，即48 h 内血肌酐上升26.5 μmol/L（0.3 mg/dL）或较基础值升高 ≥50%；和/或24 h尿量＜1.0 mL/(kg·h)（排除梗阻性肾病或脱水状态）。

1.2.4 观察指标 主要观察指标为重度窒息新生儿尿液细胞周期停滞标志物IGFBP 7×TIMP-2 动态变化；次要观察指标为重度窒息新生儿AKI的发生率以及血清肌酐的动态变化情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以中位数（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析尿液IGFBP7×TIMP-2诊断窒息新生儿发生AKI的临床意义。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

符合募集条件的新生儿共58例，家长知情并同意被募集的新生儿53例，排除1例有严重先天畸形者及1例，有巨大腹腔占位者，最终纳入正式分析的新生儿共51例。51例新生儿中，男26例、女25例，平均胎龄（38.34±1.71）周，出生体质量（3 130.6±460.2）g。

AKI组9例，发生率为17.65%，其中男5例、女4例；非AKI组42例，男21例、女21例。两组间性别、胎龄、出生体质量，1分钟和5分钟Apgar评分的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组新生儿一般资料比较

51例新生儿有48例新生儿行全身亚低温治疗，3例患儿因入院时病情危重、生命体征不稳定未能行亚低温治疗。AKI 组新生儿中有1 例因重度窒息合并多脏器功能障碍综合征，经治疗无效于生后43 h 死亡，仅留取了入院时和生后24 h的样本。AKI组其他新生儿与非AKI组新生儿均治愈出院。

2.2 两组新生儿尿液TIMP-2、IGFBP7、IGFBP7× TIMP-2及血清肌酐比较

与非AKI组相比，AKI组新生儿入院时、生后24 h 尿液中TIMP-2浓度明显增高，入院时尿IGFBP7浓度增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AKI组新生儿入院时、生后24 h尿IGFBP7×TIMP-2较非AKI组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间血清肌酐浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 入院时尿液IGFBP7×TIMP-2对重度窒息新生儿AKI发生的诊断价值

采用ROC 曲线分析重度窒息新生儿尿液IGFBP7×TIMP-2对AKI的诊断价值（图1），重度窒息新生儿入院时尿液IGFBP 7×TIMP-2 预测AKI 的曲线下面积（AUC）为0.905（95%CI：0.820～0.990），当临界浓度为0.306 (ng/mL)2时，诊断AKI的灵敏度为100%，特异度为89.0%；重度窒息新生儿生后24时尿液IGFBP 7×TIMP-2预测AKI 的AUC 为0.729（95%CI：0.482～0.977）。

图1 重度窒息新生儿尿液IGFBP7×TIMP-2 对AKI 诊断预测价值的ROC 分析

3 讨论

新生儿窒息是围生期新生儿死亡和致残的主要原因之一[1]。全球每年约有400万新生儿经历出生时窒息，每年有约90.4万新生儿死亡，幸存者易出现缺氧缺血性后遗症，部分甚至存在终生的精神和身体残 疾[9]。因此新生儿窒息后重要脏器损伤的预防和治疗，一直是基础科学和临床研究的重点。最近的全国新生儿窒息多器官损害临床诊断多中心研究协作组研究显示，在487 例重度窒息和轻度窒息新生儿中肾损害高达36.2%和26.7%[10]，故需重视其发生机制的相关研究。

AKI是指各种原因引起的急性肾脏功能下降，可伴或不伴有少尿或无尿的一组临床症候群。由于新生儿肾血流量占心输出量少，对肾血流量的改变十分敏感，当窒息、低血容量等原因导致血流重新分布时，极易发生AKI。根据目前国外的报道，在窒息新生儿或亚低温治疗的新生儿中，AKI 的发生率可达36%～70%[11-12]。在新生儿重症监护病房中，AKI 的发病率约8%～24%[13]。本研究中，新生儿重度窒息后AKI发生率为17.65%，与国外文献报道相仿。

肾小管上皮细胞是成人和新生儿AKI 时的主要受损细胞，也是肾脏损伤后再生修复最主要的细胞来源。影响肾小管上皮细胞损伤修复的因素很多，其中细胞周期调节对于肾小管上皮细胞损伤修复过程起至关重要的作用[14]。研究发现，TIMP-2 和IGFBP-7的相对分子质量分别为24 000和29 000，在细胞损伤（如氧化应激、毒素、缺血、败血症、炎症）的早期阶段由肾小管上皮细胞通过自分泌和旁分泌模式分泌。其中TIMP-2刺激p27蛋白表达，IGFBP7直接增加p53和p21蛋白的表达，从而阻断周期蛋白依赖蛋白激酶复合物CyclD-CDK4和CyclE-CDK2促进细胞周期的作用，导致短暂的G1细胞周期停滞，为细胞提供修复DNA损伤和恢复功能的机会[2,15-17]。这一过程发生在早期细胞应激过程中，有助于防止进一步的DNA 损伤和分裂，但持续的细胞周期阻滞会导致纤维化[17]。

2013年曾报道了细胞周期停滞标志物TIMP-2和IGFBP 7 在AKI 中的早期预测作用，该研究评估了超过300种不同的AKI早期生物标志物，发现尿TIMP-2和IGFBP 7 乘积（IGFBP 7×TIMP-2）作为预测AKI早期生物标志物的AUC 为0.80，明显优于单一指标或其他生物标志物，包括中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-related apolipoprotein,NGAL）、肾损伤分子1（kidney injury molecule-1,KIM-1）和白介素（IL）-18 等[3]。随后陆续有研究显示，TIMP-2 和IGFBP 7 是早期识别AKI 的新型肾损伤标志物。在具有AKI 高风险的住院患者中检测尿TIMP-2 和IGFBP 7，可以早期识别AKI，其预测AKI的灵敏度为78%，特异度为89%，AUC为0.78[4]。另有研究也发现，IGFBP7×TIMP-2可早期预测ICU中的危重患者AKI的发生，其灵敏度为73.5%，特异度为71.4%，IGFBP 7×TIMP-2＜0.8(ng/mL)2的患者可排除需肾脏替代治疗的可能[5]。在一项150例儿童体外循环手术后预测AKI 生物标志物的研究中也发现，术后6小时TIMP-2和IGFBP7明显增高，两者的高表达可高度预测AKI发生的可能性[6]。对于接受大手术、心脏手术的患者、血流动力学不稳定或脓毒症患者，IGFBP7×TIMP-2是目前预测早期AKI发生最好的生物标志物，以便进行早期诊断和干预[2]。

本研究观察了重度窒息新生儿尿液细胞周期停滞标志物TIMP-2、IGFBP-2 及其乘积（IGFBP 7× TIMP-2）及血清肌酐的动态变化规律，发现与非AKI 组相比，AKI 组新生儿入院时、生后24 h 尿液中IGFBP 7×TIMP-2 表达明显增高，优于两者单一指标。且采用相关性分析发现，重度窒息新生儿尿液IGFBP 7×TIMP-2 与血清肌酐浓度呈显著正相关。本研究通过ROC 曲线分析发现，入院时尿液IGFBP 7×TIMP-2 诊断重度窒息新生儿AKI 的AUC 为0.905（95%CI：0.820～0.990），临界浓度为 0.306(ng/mL)2时，预测重度窒息新生儿发生AKI 的敏感度为100%，特异度为89.0%。血清肌酐浓度虽然是诊断AKI 的KDIGO 标准之一，但是一般升高比较晚，在肾损伤后48～72 h 才升高；而且新生儿出生后几天内的血清肌酐浓度反映的是母亲的肾功能，而不是新生儿的肾功能。本研究发现，AKI 组的血清肌酐浓度虽较非AKI组有增高趋势，但两者差异无统计学意义。

综上所述，本研究发现尿液细胞周期停滞标志物IGFBP 7×TIMP-2 在重度窒息新生儿生后早期可明显增高，有助于早期识别AKI 的发生。今后有必要进一步扩大研究样本，明确尿液IGFBP7×TIMP-2在早期诊断AKI中的确切临床价值。