番石榴结合态多酚对小鼠肠道菌群结构及多样性的影响研究

谢 甜 孙 琳 范 伟 郭时印 肖 航,2 唐忠海,*

(1 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410000；2 麻省大学阿莫斯特分校食品科学系，美国 马萨诸塞州 阿莫斯特 01003)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一种重要的水果作物，广泛种植于热带和亚热带地区，味甜、质地脆，富含多酚[1-2]、黄酮[3]、甾体激素[4]、维生素C、膳食纤维、胡萝卜素、脂肪和氨基酸等多种活性物质[5]。近年来，人们对番石榴的营养成分、活性成分及药理作用进行了深入研究，使番石榴在医药和食品领域得到了广泛的应用[6-7]。

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物，主要存在于植物的皮、根、叶和果中。多酚有多种分类方式[8]，根据分子结构，可将其分为简单酚类、酚酸类、单宁类、黄酮类、异黄酮类和萘醌类等类型[9]；根据多酚的结合方式可将其分为游离态多酚(free polyphenols，FP)和结合态多酚(bound polyphenols，BP)，FP是指通过简单的有机溶剂萃取就可以获得的多酚；BP是需先通过化学或酶处理，破坏多酚物质与细胞壁结合的化学键，才能分离得到的多酚[10-11]。多酚具有抗氧化[12]、抗癌[13-14]，诱导基因表达[15]、降低血浆脂质氧化产物浓度[16]等作用。红心番石榴是番石榴的重要品种之一，其游离多酚、结合态多酚以及总多酚含量较高，抗氧化活性较强[17-20]。

肠道微生物菌群的结构、功能及其产生的生物活性代谢产物对维持人体肠道健康具有重要意义[21]。它们通过发酵大肠中不可消化的膳食成分，为宿主提供营养和能量，并促进宿主的代谢和免疫系统保持平衡[22]。研究表明，肠道菌群的结构组成受环境、年龄、生理状况、饮食等多种因素的影响，会在一定范围内波动[23]。而失衡的肠道菌群不但会引起消化道的感染、炎症等疾病，也会极大地增加人体罹患糖尿病、肥胖症、消化道癌症等慢性疾病的风险[24-25]。随着年龄的增长，肠道菌群平衡被打破，有益菌尤其是以革兰氏阳性菌如双歧杆菌为主的某些肠道菌群减少，有害菌增加[26]。

目前，针对番石榴结合态多酚的研究较少[27]。本研究以CD-1小白鼠为研究对象，采用灌胃的方法给予不同剂量的红心番石榴结合态多酚，通过16S rRNA基因扩增子测序技术[28-30]，研究结合态多酚对小鼠肠道菌群结构及多样性的影响，以期为番石榴结合态多酚的研究与应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

30只4周龄健康CD-1雄性小鼠，许可证号SYXK(粤)2019-0136，SPF级，每只体重约20～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公司；红心番石榴采自福建省漳州市诏安县。

Nucleo Spin 96 Soi DNA提取试剂盒，德国Macherey Nagel公司；没食子酸标准品(纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；无水碳酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)、福林酚(分析纯)，合肥博美生物科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

5424R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Agilent-8453E型紫外可见分光光度计，德国安捷伦科技公司；MK-3酶标仪，上海Thermo Labsystems公司；LC-10ATVP plus高效液相色谱仪，日本岛津公司；9700型PCR仪，美国ABI公司；M2e多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.3 试验方法

1.3.1 结合态多酚的提取 参照骆亚丽等[31]的方法，获得红心番石榴果渣，即结合态多酚。

1.3.2 结合态多酚不同组分分析 采用高效液相色谱-电离子喷雾质谱联用(high performance liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry，HPLC-ESI-MS)法对结合态多酚不同组分进行检测，将结合态多酚样品溶于甲醇溶液，进样量10 μL，浓度10 mg·mL-1，检测前样品溶液过0.22 μm微孔滤膜，使用乙腈-水体系进行梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式检测，使用YMC C18色谱柱，流动相：甲醇(A)/0.1%三氟乙酸水相(B)，流速：1 mL·min-1，检测波长：280 nm。

对于神话、传说，咱老百姓就说：“我给你说说这个某某神(鬼)的事儿吧，我给你说说那个某某神(鬼)的事吧。”像神话、传说、故事都是书面意义，老百姓们不那么说。耿村一开始还没被发现的时候，周边人说耿村是“笑话村”，后来专家们证实后就改叫“故事村”。再后来大家总是听过来采访的人、专家、学者们说讲个故事、传说之类，他们才把“笑话”改成“故事”或者“传说”。

1.3.3 动物饲养 小鼠饲养于华南农业大学实验动物中心，保持温度26±1℃，昼夜节律12 h/12 h，正压通风。小鼠可以自由饮食、饮水，动物房所用的饲料、垫料、鼠笼、饮用水、饮水瓶均经过高温高压消毒(121℃，60 min)。

1.3.4 动物试验 将小鼠分为空白组、高浓度组(500 mg·kg-1)、低浓度组(100 mg·kg-1)，每组10只，共饲养5周，适应期为1周，并按照5只1笼的原则分笼饲养，每5只小鼠将隔天轮转至不同的笼子里以适应环境，适应期结束后，将小鼠随机分组，以最大程度地消除可能存在的母体效应。3组小鼠均食用AIN93G饲料，灌胃期间，分别于灌胃第1、第5、第9、第13、第17、第21、第25、第29天早晨空腹称重，计算小鼠各生长阶段的平均日增重(average daily gain，ADG)[28]。

每天下午4点对小鼠进行灌胃，每只小鼠灌胃4 mL，空白组为无菌水，试验组为不同浓度的番石榴渣(结合态多酚)，灌胃2 h之后各组正常饮水，结合态多酚以无菌水溶解，振荡摇匀，现配现用。

1.3.5 粪便收集 灌胃前一天、灌胃后第2周和灌胃结束当天(第29天)收集新鲜粪便，分装于无菌离心管内，密封，-80℃冻存。在第5周试验结束时，将小鼠用浓度为1%(40 mg·kg-1)的戊巴比妥钠麻醉，每组各收集小鼠粪便30 g以上(每只老鼠不少于3 g)，置于干燥灭菌试管中，于-80℃冰箱保存待测。

1.3.6 样品处理 取出小鼠粪便样品解冻，首先用粪便组基因DNA提取试剂盒提取DNA，电泳检测合格后，选择基因高变域V3-V4进行PCR扩增。使用酶标仪对PCR产物进行定量，并进行混合。构建文库后通过Illumina Miseq PE 300平台进行测序[32]。

1.3.7 生物信息学分析 在0.97相似度下对序列聚类，每个操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)代表一个物种，将OTU代表序列进行物种注释，并与相应的微生物数据库比对，统计样本的群落结构，获得分类信息及相对丰度[33-34]，并通过统计ACE、Shannon等指数对样本进行α多样性分析[35-36]，运用主坐标分析法进行β多样性分析[37]。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 结合态多酚各组分鉴定

如图1所示，结合态多酚中有大量的多酚类物质。通过HPLC-ESI-MS负离子扫描，根据色谱峰的相对分子量、化学式、碎片离子峰，以及文献中报道的多酚碎片峰信息[38-39]，推测各峰代表的化合物： 1没食子酸、2鞣花酸、3阿魏酸、4绿原酸、5对香豆酸、6番石榴苷。

图1 结合态多酚的反相柱-液相色谱图谱Fig.1 RP-HPLC spectrum of bound polyphenols

2.2 小鼠体重变化

由表1可知，灌胃组与空白组小鼠的体重差异不显著(P>0.05)，表明结合番石榴态多酚不会对正常小鼠的体重造成显著影响。

表1 结合态多酚灌胃期间小鼠体重变化(n=10)Table 1 Changes on body weight in mice during administration of bound polyphenols(n=10) /g

2.3 菌群α多样性分析

反映物种数量即丰富度的指数包括Observed、Chao1和ACE指数。反映物种均匀性的指数包括Shannon和Simpson指数[40-41]。Observed指数越大说明物种越丰富，Chao1和ACE指数的数值大小含义同理。

Shannon与Simpson指数的高低与群落多样性的高低呈正向关系[42]。Coverage指每个样本的覆盖率，代表能检测到序列的概率，数值越大说明结果越贴近实际情况[43-44]，经分析，3个试验组的Coverage都在99.9%以上，说明测量结果能准确反映真实情况。

如图2和表2所示，与空白组相比，低浓度组中菌群的Observed(OTU)指数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数以及Simpson指数均显著提高(P<0.05)；但在高浓度组中菌群的这五类指数均显著降低(P<0.05)，说明低浓度组番石榴结合多酚能显著提高小鼠肠道菌群的丰富度和均匀性，促进α多样性，相反高浓度组会抑制α多样性。

表2 α多样性指数比较Table 2 Comparison of Alpha diversity indexs

注：“0”表示灌胃前期，“1”表示灌胃中期，“2”表示灌胃结束，“Blank”表示空白组，“Low”表示低浓度组，“High”表示高浓度组。下同。Note: ‘0’ means pre-gavage, ‘1’ means mid-gavage, ‘2’ means end of gavage, ‘Blank’ means blank group, ‘Low’ means low concentration group, and ‘High’ means high concentration group. The same as following.图2 结合态多酚对小鼠肠道菌群α多样性的影响Fig.2 The effect of bound polyphenols on Alpha diversity in mice

2.4 菌群β多样性分析

主坐标分析法(principal coordinates analysis，PCoA)是评估β多样性的常用方式之一，根据不同的距离算法实现定性数据的定量转换[36]。因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，反之则会远远分开[37]。

由图3可知，灌胃组与空白组样本点分布的区域在整个试验过程中(包括适应期)基本都有交集，即灌胃组肠道细菌菌落与空白组无显著差异，说明结合态多酚对小鼠肠道菌群群落结构无显著影响。

注：两点之间距离越近表明二者的群落构成差异越小。Note: The closer the distance between the two points, the smaller the difference in community composition between the two points.图3 小鼠粪便微生物菌群主坐标分析Fig.3 The principal coordinates analysis of microbial flora in mice feces

2.5 番石榴结合态多酚对肠道菌群物种组成的影响

2.5.1 基于门水平上的影响 由图4可知，各组样本肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)5种菌门为主，相对丰度之和在95%以上，其中厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门3个菌门的相对丰度值最大。另外，由图5、6可知，比例较高的还有脱铁杆菌门(Deferribacteres)、埃普西隆杆菌门(Epsilonbacteraeota)、蓝藻门(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)及1种未分类拟杆菌门(Patescibacteria)[45]。

图4 小鼠肠道菌群门水平相对丰度的变化Fig.4 Relative abundance of mice intestinal flora at the phylum level

注:横坐标的第一个数字1，2，3分别代表灌胃前、中、结束期，第二个数字中的1～6、7～12、13～18分别代表空白组、低浓度组以及高浓度组。Note:The first number 1,2,3 on the abscissa represents the early, middle and end of gavaged administration respectively, and the 1 to 6, 7 to 12, 13 to 18 in the second number represents the blank group, low concentration group and high concentration group namely.图5 所有样品肠道菌群门水平的物种相对丰度Fig.5 Species relative abundance of all sample gut microbiota at the phylum level

注：图中每一列表示一个样本，每一行表示一个OTU，颜色深度表示OTU中包含的读取数值，越接近红色相对丰度越高。Note:Each column in the figure represents a sample, and each row represents an OTU. The colorrepresents the read value containedin the OTU. The closer is to the red, the higher the relative abundance is.图6 肠道菌群门水平物种丰度聚类图Fig.6 Species abundance cluster graph of intestinal flora at the phylum level

灌胃结束时，相对于空白组，高浓度组的厚壁菌门的相对丰度下降了19.23%，而低浓度组上升了7.30%。低浓度组和高浓度组拟杆菌门的相对丰度分别下降了1.27%和21.31%。疣微菌门的相对丰度则表现为低浓度组下降了7.66%，高浓度组上升了38.41%，疣微菌门在肠道微生物生态系统中起着重要作用，其一些成员具有多糖水解酶活性[46]。低浓度组与高浓度组放线菌门的相对丰度分别上升了1.10%和0.30%；高低浓度组变形菌门的相对丰度分别上升了1.25%和0.20%。综上所述，番石榴结合态多酚会导致肠道菌群结构发生变化，影响门水平菌群的相对丰度。

2.5.2 基于属水平上的影响 由图7可知，从小鼠粪便中鉴别出10个门96个属，主要包括疣微菌门的艾克曼菌属(Akkermansia)，厚壁菌门的乳杆菌属(Lactobacillus)，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的未知属Ruminiclostridium_9，拟杆菌门的拟杆菌属(Bacteroides)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides)，理研菌科(Rikenellaceae)的未知属Rikenellaceae_RC9_gut_group及另枝菌属(Alistipes)。其中艾克曼菌属、乳杆菌属和拟杆菌属3个菌属的相对丰度最高。

图7 小鼠肠道菌群属水平相对丰度的变化Fig.7 Relative abundance of mice intestinal flora at thegenus level

与空白组相比，低浓度结合态多酚处理艾克曼菌属的相对丰度降低了7.66%，而高浓度组提高了38.41%，艾克曼菌属属于新抗癌明星细菌，在增加癌症免疫治疗效果上有非常显著的作用，其丰度与几种疾病状态呈负相关，如炎症性肠病、急性阑尾炎、2型糖尿病等[47-51]，有成为下一代益生菌的潜力[52]。大量研究表明，乳杆菌能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，具有改善胃肠道功能等多种有益功效[53]，其相对丰度在低浓度组中升高了1.85%，相反在高浓度组降低了2.15%；Tannock[54]和Hughes等[55]研究证明拟杆菌在肠道内的增多会有致癌作用。高、低浓度组拟杆菌属的相对丰度分别降低了13.69%和7.71%，说明番石榴结合态多酚能够调整肠道菌群结构，促进有益菌增长，抑制有害菌增长，且其作用效果与浓度密切相关，高低2种浓度的作用不完全相同。

3 讨论

影响肠道菌群构成和平衡的重要外在因素包括分娩方式[56]、膳食类型[57-58]和药物治疗[59]。大量研究表明，番石榴中的总多酚与游离态多酚[60-62]、番石榴叶提取物[63-64]、番石榴皮及其提取物[65-66]等均对人或小鼠的肠道菌群结构具有调节作用。除番石榴多酚外，绿茶多酚也会对小鼠肠道菌群结构产生一定的调节作用[67]。

多酚类物质作为功能性物质[68]，可通过为肠道内微生物提供代谢底物及自身特性的发挥抑制肠道内有害菌群的生长，减少致病菌带来的毒性[69-70]；同时，多酚类物质可以抑制部分酶的活性，进而影响肠道内的一系列酶化反应[71]。本研究在已有对番石榴总多酚与游离态多酚对肠道菌群的影响的研究基础上，对结合态多酚的作用进行了研究。采用16S rRNA基因扩增子测序技术，统计小鼠肠道菌群菌落结构的分类信息及相对丰度，证明番石榴结合态多酚虽对小鼠肠道菌群的群落结构无显著影响，但能显著提高小鼠肠道菌群的丰富度和均匀性，促进α多样性，调整肠道菌群结构，如改变厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门、变形菌门、放线菌门5种优势菌门的相对丰度，提高有益菌艾克曼菌属、乳杆菌属的相对丰度，降低有害菌拟杆菌属的相对丰度，改善肠道健康。游离态多酚作用已有文献记载[72-73]，可见番石榴总多酚中的两大成分均对小鼠肠道菌群结构具有调节作用。同时不同浓度的番石榴结合态多酚的作用不完全相同，如低浓度能显著提高小鼠肠道菌群丰富度，高浓度却无显著作用；低浓度会降低有益菌艾克曼菌属的相对丰度，高浓度则提高该菌属相对丰度。该结果显示，番石榴结合态多酚的浓度与其实际调节作用有着密切关系，过高过低都可能会造成不利的影响，后期研究应扩大番石榴结合态多酚浓度范围及给药样本量，进一步考察不同浓度的作用。

4 结论

本研究通过16S rRNA基因测序技术，分析番石榴结合态多酚对小鼠肠道菌群结构及多样性的影响，发现番石榴结合态多酚对小鼠肠道菌群的丰富度和均匀性有明显促进作用，且对菌群结构具有调节作用，既能提高益生菌比例，也能降低有害菌比例。另外，不同浓度番石榴结合态多酚对同一菌种造成的影响可能相同也可能相反，过高过低都可能会造成不利的影响。后期研究需进一步考察更大范围浓度对小鼠肠道菌群的调节作用，并探讨其在降低血糖、血脂等方面的作用。