南瓜栽培品种的SSR分子标记分析及农艺性状多样性研究

黄凯美 邹宜静 施杨琪 应逸宁 颜韶兵 包劲松,,*

(1 杭州市农业技术推广中心,浙江 杭州 310017；2 浙江大学农学院应用生物科学系,浙江 杭州 310058；3 浙江大学原子核农业科学研究所,浙江 杭州 310058)

南瓜属(Cucurbita，2n=2x=40)是葫芦科植物中果实性状最具多态性的属，共包括30余种，其中中国南瓜(C.moschatoDuch)、美洲南瓜(C.pepoL.)、印度南瓜(C.maximaDuch)是主要栽培种[1-2]。目前，我国是世界上最大的南瓜消费国和生产国[2]，但南瓜作为一个小种类的蔬菜，遗传与育种研究仍较为缺乏[3]。因此，开展关于南瓜品质和产量方面的研究对南瓜品种改良具有重要意义。

我国南瓜种质资源丰富，为南瓜育种工作的开展提供了必要的物质基础[4]。20世纪90年代后期，一些科研单位以地方品种蜜本南瓜为主要亲本，开展了中国南瓜的育种工作[3]。印度南瓜的引进也促进了我国印度南瓜的育种研究，在新品种培育方面取得了一些重要进展[4]。但是由于不同地区间频繁引种及自繁自育，导致现有南瓜品种间品系交错、亲缘关系混杂，“同名异物”与“同物异名”现象屡见不鲜[5-6]。随着地方品种收集工作的有效开展，发现众多地方品种与育成品种间的亲缘关系尚缺乏研究[7]。

简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)标记，又称微卫星标记[8]，是一种由几个核苷酸(一般小于6个)为重复单位形成的分子标记。SSR标记具有出现频率高、多态性丰富、检测手段简单、检测结果重复性好等优点，被广泛应用于遗传多样性分析、亲缘关系分析、品种鉴定等研究领域[9-10]。随着南瓜基因组信息的测定和公开，大量SSR标记被开发并应用于南瓜品种的遗传多样性研究。王洋洋等[11]对印度南瓜进行了转录组测序分析，共检测到12 557个SSR位点，分布于131 960条基因中；随后选取20对引物分析30份南瓜材料的遗传多样性，发现14对引物可扩增出产物，11对引物具有多态性。朱海生等对美洲南瓜[12]和中国南瓜[13]进行转录组测序分析，分别检测到7 478和5 407个SSR位点，分布于5 786和4 348条基因中，并选取部分引物剖析了美洲南瓜和中国南瓜的遗传多样性。武向斌[14]从南瓜、西瓜、黄瓜、甜瓜、苦瓜、丝瓜、冬瓜基因组中开发出种间SSR标记，发现96对引物中有87对在葫芦科的7个种中具有良好的通用性。

本研究采用SSR标记分析35份南瓜品种的遗传多样性，特别是浙江地方品种十姐妹南瓜、上海地方品种黄狼南瓜、广东地方品种密本南瓜与其他育成品种间的遗传关系，以期揭示南瓜品种间的遗传差异及亲缘关系，为南瓜的新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的35份南瓜品种来自湖南、北京、浙江、广东、上海、山东、安徽、河北、辽宁9个省市，包含印度南瓜、中国南瓜、美洲南瓜3个主要栽培种(表1)。所有供试材料于2020年8月10日在杭州临安区板桥镇杭州锦兴农业开发有限公司基地种植，常规水肥管理。于2020年秋季收获成熟期果实。

表1 试验所用南瓜品种及其主要农艺性状Table 1 The major agronomic traits of squash accessions used in this study

表1(续)

1.2 试验方法

1.2.1 性状调查 分别在营养生长期和开花期开展农艺性状调查，每个品种随机取10株进行测量，同时记录开花较早或较迟、抗病性好的品种。成熟期每个品种随机收取10个果实考查果实性状。性状调查参照《南瓜种质资源描述规范和数据标准》[15]，数量性状用平均值表示(表1)。

1.2.2 DNA提取 采用改良的CTAB法[16]提取南瓜叶片的基因组DNA：裁剪南瓜叶片约0.5 g，洗净后保存在-20℃冰箱中备用。加入适量液氮将叶片研磨成粉，转入1.5 mL的离心管中。离心管中加入600 μL预热至65℃、浓度为20 g·kg-1的CTAB提取缓冲液，旋涡振荡混匀。将离心管置于65℃水浴锅提取30 min，期间每隔10 min轻轻摇晃离心管，使之充分混匀；取出离心管冷却2 min后，12 000 r·min-1离心10 min，转移上清液至新离心管中，加入600 μL氯仿，轻轻摇匀；12 000 r·min-1离心10 min，转移上清至含有乙醇的离心管中，将离心管上下颠倒混合均匀，此时有絮状DNA产生；12 000 r·min-1离心5 min，小心弃去上清液，保留底部DNA沉淀，加入无菌水使DNA溶解后，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR与电泳 SSR引物序列见表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR采用10 μL反应体系，由5 μL 2×PCR Mix、1 μL DNA模版(100 ng)、0.5 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL及3 μL双蒸水组成。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物在100 g·kg-1的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，缓冲液为0.5×TBE，恒压120 Ⅴ，电泳时间视产物片段大小决定。取出凝胶后用蒸馏水清洗2遍，在1.0 g·kg-1的硝酸银溶液中染色5～7 min，用蒸馏水再次清洗2遍，用8.0 g·kg-1甲醛-10 g·kg-1氢氧化钠溶液显色5～7 min，蒸馏水清洗2遍后取出，扫描结果。

1.2.4 数据统计分析 根据电泳结果，统计各样本的基因型。使用Powermarker V3.25[17]分析数据，利用非加权组平均法(unweighted pair group average method with arithmetic mean，UPMGA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记检测

利用43对SSR标记(表2)分析35份南瓜品种材料的遗传多样性和种群结构，每对引物在35份样品间都能够扩增出多态性条带(表3)。43对SSR引物共检测到155个等位基因，每个标记所检测到的等位基因数为2～7个，平均为3.6个；主要等位基因频率为0.308 8～0.928 6，平均为0.550 1。检测到177个基因型，每对引物所检测到的基因型为2～7个，平均为4.1个。43对引物基因型杂合度在0～0.823 5之间，平均值为0.199 2。SSR标记的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)值在0.130 8～0.775 4之间，平均值为0.487 2。基因多样性在0.135 2～0.802 3之间，平均值为0.551 7。

表2 43对SSR引物序列Table 2 The primer sequences of 43 SSR markers

表2(续)

试验结果表明，所有SSR标记在35份南瓜品种间均具有较好的基因多样性和较高的遗传杂合性，但在区分不同类型南瓜品种间有所差别。例如，标记S78、n15不能区分品种PM01～PM12、PM14(图1-A、B)；标记S78和S17不能区分品种PM15～PM17、PM19～PM29(图1-A、D)；图中所示4个标记都无法将品种PM34～PM37区分开，说明所列举的分子标记在上述种内品种间没有多态性，但是在不同种间存在多态性，即存在南瓜的种间特异性。目前，在本研究中未发现对全部供试品种均具有多态性的通用SSR分子标记。

注：引物分别为：A：S78；B：n15；C：S190；D：S17。Note:SSR markers:A:S78.B:n15.C:S190.D:S17.图1 35份南瓜材料PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis images of 35 squash accessions with SSR markers

2.2 聚类分析

利用UPGMA聚类方法将43对SSR标记的扩增结果进行聚类分析，以确定35份供试南瓜品种间的亲缘关系。结果表明，35份品种可以分为三大类，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类(图2)。与表1中各样品对应的南瓜品种对应，第Ⅰ类包含13个品种(PM01～PM12、PM14)，均为中国南瓜；第Ⅲ类包含5个品种(PM29～PM33)，为美洲南瓜；第Ⅱ类包含17个品种(PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)，为印度南瓜。第Ⅰ类中，PM10与其他几个品种的亲缘关系最远，SSR标记无法区分PM01和PM02。第Ⅱ类分为3个亚群，其中PM34～PM37与其他品种亲缘关系最远，PM26～PM28与其他品种亲缘关系较远。第Ⅲ类中PM31与PM33亲缘关系较近，PM29、PM30、PM32亲缘关系较近，为2个亚群。浙江省著名地方品种十姐妹南瓜(PM08)为中国南瓜，与PM04、PM06、PM07和PM11亲缘关系较近。上海著名地方品种黄狼南瓜(PM12)为中国南瓜，与PM03亲缘关系较近，与PM08亲缘关系较远。广东省著名地方品种密本南瓜PM09是南瓜育种的重要材料，与广东的香芋南瓜PM14亲缘关系最近。

图2 基于SSR标记的35份南瓜品种聚类分析Fig.2 Cluster tree of 35 squash accessions based on SSR markers

2.3 南瓜农艺性状及果实性状

第Ⅰ类(中国南瓜，PM01～PM12、PM14)都为蔓生，多在主蔓结瓜，PM09、PM12和PM14在侧蔓结瓜。叶片多为掌状，PM06、PM09和PM11为心脏五角状，PM14为近圆形。茎都为五棱形。雌花萼片上部扩大成叶状。果实形状多样，以梨形略多。果皮为深绿色或墨绿色，PM03、PM09、PM14披有不规则花纹。瓜面平滑，瓜肉色淡黄。果肉厚0.70～1.75 cm。以嫩果或老熟果供食用，嫩果采收时果重差异明显，果重为393.5(PM07)～783.0 g(PM10)。品质性状中口感大多为脆，肉质松软和致密都较为常见。

第Ⅱ类南瓜(印度南瓜，PM15～PM17、PM19～PM28、PM34～PM37)包含的品种较多，整体性状多样，形态丰富，异质化程度高。所有品种都为蔓生，始花节位最高为34节，最低为13节。大多为主蔓结瓜，PM15～PM17为侧蔓结瓜。叶形以掌状为主，茎为近圆形。果实形状多样，其中扁圆形较为常见。瓜皮底色有灰绿色、绿色、深绿色、黑绿色、白色等，明显或隐约有深绿色、浅绿色、灰绿色等斑纹。瓜面平滑，瓜肉色淡黄到黄色。果实体积不等，单果重203.5～1 306.0 g。质地以致密较多，口感多样，以粉、面为主。

第Ⅲ类南瓜(美洲南瓜，PM29～PM33)为蔓生或矮生，始花节位多在12节或13节，且多在主蔓结瓜。叶形为近三角形，茎有棱或沟，瓜形大多为扁圆形。瓜皮颜色多样性丰富，有白色、淡黄白色、浅绿、浅黄色或黄橙色带纵条纹。瓜面平滑或多棱，果肉较厚，色白至淡黄。果实体积不等，PM29～PM31呈扁圆型果型小，单果重270.0～353.0 g，PM32、PM33分别呈椭圆形和圆筒形，单果重505.5～791.0 g。肉质致密、松软，口感面、脆、粉均有。另外，PM29～PM31兼有观赏价值。

3 讨论

南瓜表型的多样性使其能适应各种各样的自然环境，从而在不同条件下进行种植，满足食用、药用、籽用、观赏等栽培目的，具有极高的经济价值[2-3,15]。因此，了解南瓜表型多样性的遗传信息对推进南瓜育种工作具有重要的意义。本试验详细调查了不同南瓜栽培品种间农艺性状的差异，发现不同类群间在叶形、果形及果实质地等方面具有共同特点，为今后的育种工作提供了良好的研究基础。在三大类中，每一类型都分别含有大果品种和小果品种，说明不同种之间及种内的不同品种之间都表现出了果实形状及大小的多样性。第Ⅰ类南瓜中，PM02、PM05、PM09长势较好，PM03、PM07、PM10和PM11是早熟品种，PM02和PM05抗白粉病较强，可作为选育高产早熟高抗品种的亲本。第Ⅱ类南瓜中，PM27和PM28结瓜较多，PM21、PM24和PM25综合性状优良，可以作为群体品种参与育种。第Ⅲ类南瓜中，PM32、PM33和PM37节间短，可以作为亲本育成矮化、耐肥品种。不同类型农艺性状的多样性有助于开展种间杂交，从而可以将不同种的优异性状结合起来，培育高产、优质、多抗的南瓜新品种。如，将第Ⅰ类中的著名地方品种密本南瓜(PM09)与第Ⅲ类中节间短的品种PM32或PM33杂交，有望选育出矮化高产的新品种。

除了表型遗传多样性，DNA分子标记已广泛应用于遗传多样性和植物亲缘关系鉴别研究。简单重复序列(SSR)标记自1994年[8]建立以来，因其多态性良好、分辨率高、遗传信息量丰富、数量多、重复性好、操作简便等优点被广泛利用，目前已经成为应用最广泛且最重要的遗传标记之一，应用于指纹数据库构建、分子辅助选择育种、遗传多样性分析和品种纯度鉴定等相关研究。本研究利用43对SSR引物，对35份样品进行PCR检测，共检测到155个等位基因，平均每个标记位点能检测到3.6个等位基因，每个标记所检测到的等位基因数为2～7个，PIC为0.130 8～0.775 4，平均值0.487 2。武向斌[14]利用66对SSR引物对61份美洲南瓜样本DNA进行了扩增，发现平均每个标记位点能检测4.2个等位基因，PIC平均值为0.43。朱海生等[13]利用30对SSR引物对30份中国南瓜样本开展遗传多样性分析，发现每对引物检测到的等位基因为1～5个，平均值为2.11个。周秦等[18]利用26对SSR引物对26份南瓜核心种质资源进行了扩增及多态性评价，每对引物检测到的等位基因数目为1～12个，平均值为4.5个，PIC平均值为0.460。王迎儿等[22]利用26对SSR标记对41份均来源于浙江省内的南瓜种质资源材料进行了遗传多样性分析，平均每对引物检测到5.4个等位基因，PIC平均值为0.58。王瑞等[20]利用150对引物对24份由广东省农科院采集的南瓜种质资源样本进行扩增，平均每对引物检测到4.8个等位基因。与之前的试验相比，本试验所选用的SSR标记具有良好的多态性，标记的平均等位基因数比王迎儿等[22]的研究结果稍少；与武向斌[14]的研究类似，本研究在一定程度上展示了南瓜种质资源的丰富性和差异性。结合基因型和表型的数据，可以通过关联分析找到与这些农艺与果实性状显著关联的分子标记[23]。但是，开展关联分析相关研究需要更多的南瓜品种并发掘更多的分子标记。

利用UPGMA方法对35份材料进行聚类分析，结果显示南瓜材料可明显分为三大类，对应中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3个种。与周秦等[18]、王迎儿等[22]发现利用SSR标记可以区分不同种南瓜的研究结果一致。从聚类图可以看出，印度南瓜与美洲南瓜亲缘关系较近，这与卢丽芳等[24]、李俊丽等[25]、李海真等[26]、张天明等[27]利用其他分子标记的研究结果不一致，即上述研究中认为中国南瓜与美洲南瓜亲缘关系较近。这种差异可能是由于本研究供试品种中的美洲南瓜数量较少，代表性差，美洲南瓜根据表型可分为很多类型[28]，而本研究只收集到以观赏类型为主的5个品种。分析研究所用的分子标记系统可以发现，前人分析中都使用了显性标记[24-27]，而本研究中的SSR为共显性标记，即因分子标记类型不同，可能会导致不同的结果。以往研究还发现在相同栽培种的不同品种间，可进一步分为不同的类群，例如朱海生等[13]将30份中国南瓜样本分为两类：第一类包括22份材料，瓜形多为盘形、近圆形、椭圆形和扁圆形；第二类包括8份材料，瓜形多为长筒形或长颈圆筒形，其分类主要与果实的性状相关。王瑞等[20]也发现可将中国南瓜分为两类，第一类果实形状多为棒槌形，第二类多为扁圆形。武向斌[14]将61份美洲南瓜种质分为含有5份野生种质的类别Ⅰ和含有56份栽培种质的类别Ⅱ，其分类主要与是否为栽培种相关。本研究的品种聚类分析也表明，在第Ⅰ类和第Ⅱ类南瓜中，还可继续分为三类。综上可知，利用SSR标记可以区分不同种的南瓜，而且同一种内中，可以进一步区分出不同类群。

需要指出的是，虽然利用SSR标记很容易将不同南瓜类型区分开，但同一类型的不同南瓜品种很难相互区分，例如PM01和PM02的品种聚类分析。SSR标记检测的电泳结果同时体现了SSR存在种间的特异性，即同种内多态性小，不同种间多态性大，说明本研究采用的SSR标记在不同种间的通用性差。但这有利于不同类型南瓜间开展种间的杂交育种、标记辅助育种以及遗传图谱的构建。因此，为了更好地从分子水平区分同一种内的南瓜品种，需要采用通用性更好的SSR标记。为了南瓜种质资源的保护和分子育种的开展，后续研究可以利用通用性好的SSR标记建立南瓜品种的指纹图谱，以便开展特定南瓜品种的鉴定工作。

4 结论

本试验利用43个简单序列重复(SSR)标记，将35份南瓜栽培品种进行了分子层面的遗传多样性分析，通过聚类分析将其划分为中国南瓜(13份)、印度南瓜(17份)和美洲南瓜(5份)共3种栽培类型，与实际栽培种的划分相符。同时，本试验调查了不同南瓜品种的农艺性状和果实性状，发现不同种品种的农艺性状与果实性状差别明显，每个种内部分品种农艺性状较好，可以作为杂交育种的亲本。由于许多SSR标记具有种间特异性，开展南瓜种间杂交育种时，这些标记适合应用于标记辅助选择。本研究结果为国内南瓜栽培品种遗传结构的进一步研究，以及开展种间杂交分子育种的研究提供了理论依据。