热辅助超声波处理对猕猴桃浊汁的杀菌效果及品质影响研究

叶 青 赵武奇 白斯可 张济英 聂聪怡 钱 蕊 伍小丫

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

猕猴桃(Actinidiachinensis)富含氨基酸、矿物质、维生素等多种营养物质[1]，与清汁、复配汁相比，猕猴桃浊汁能更多地保留猕猴桃原有的营养成分，具有原料利用率高，香气及口感纯正等优点，受到越来越多消费者的青睐[2]。但新鲜的浊汁易受微生物和酶的影响，导致品质变差，因此，杀菌灭酶是果汁生产中的关键工序[3]。目前，浊汁杀菌主要采用高温短时杀菌和超高压杀菌。高温短时杀菌存在热敏性营养物质损失严重、色泽变暗及稳定性降低的缺点[4]；超高压杀菌存在设备投入大及密封性要求严格的缺点[5]。热辅助超声波处理是一种声热结合的杀菌技术[6]，具有安全性高、杀菌效果好、营养物质损失少的优点[7]，已在苹果汁[8]、甘蔗汁[9]、南瓜汁[10]、杨梅汁[11]、草莓汁[12]等果蔬汁加工中取得了一定的效果，将其应用于猕猴桃浊汁的杀菌对于提高产品质量具有重要意义。本试验在研究不同热辅助超声波处理工艺参数对猕猴桃浊汁理化特性的影响及杀菌效果的基础上，优化得出最佳工艺参数，以期为热辅助超声波技术应用于猕猴桃浊汁的加工过程提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秦美猕猴桃，于2019年9月采自陕西省西安市周至县佰瑞猕猴桃种植基地。选取成熟度基本一致、大小均匀、未软化、无病虫害、无机械损伤的猕猴桃。试验前将猕猴桃置于0±0.5℃条件下贮藏。

抗坏血酸，成都市科龙化工试剂厂；平板计数琼脂，北京市奥博星生物技术有限公司；碳酸氢钠，西安化学试剂厂；草酸、蒽酮、碳酸钙、蔗糖、石英砂、氢氧化钠、氯化钠，天津天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AB104-N电子天平，上海第二天平仪器厂；NS色差仪，深圳三恩驰科技有限公司；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司；8101手持式阿贝斯折光仪，大连先超科技有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；XO-SM50超声波微波协同反应工作站，南京先欧仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猕猴桃浊汁样品的制备 猕猴桃清洗→去皮→切块→榨汁→过滤(300目)→猕猴桃浊汁。

1.3.2 猕猴桃浊汁杀菌试验 取50 mL猕猴桃浊汁样品，密封包装，以超声功率、温度、超声时间为影响因素，进行Box-Behnken三因素三水平响应面试验，其中超声工作模式为：超声工作2 s后停1 s。每个试验重复3次，取平均值。响应面试验因子与水平见表1。

表1 Box-Behnken设计因子与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 试验指标的测定与计算

1.3.3.1 浊度的测定 将样品摇匀后置于比色杯中，使用色差仪在总透射(total transmission,TTRAN)模式下测定浊度，使用前用蒸馏水校正[13]。

1.3.3.2 颜色、褐变度的测定 果汁颜色测定：通过色差仪直接测定L*、a*、b*值，按照公式计算色差值(△E)：

(1)

式中，L0、a0、b0为初始样品的测定值；L*、a*、b*为杀菌后样品测定值。

褐变度的测定[14]：使用分光光度计，以蒸馏水为空白，用420 nm波长下的吸光度表示褐变度。

1.3.3.3 营养组分的测定 参考《GB/T 10468-1989水果和蔬菜产品pH值的测定方法》[15]测定酸碱度(potential of hydrogen,pH)；用酸碱滴定法测定可滴定酸(titratable acid,TA)含量，以柠檬酸计，参照《GB/T 12456-2008食品中总酸的测定》[16]；采用蒽酮试剂法测定可溶性糖含量[17]；抗坏血酸(vitamin C,Vc)含量测定采用2,6-二氯靛酚滴定法，参照《GB 5009.86-2016食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》[18]；用紫外分光光度计测定总酚含量[19]；叶绿素含量用比色法测定[20]；用手持式糖度仪测定可溶性固形物(total soluble solids,TSS)含量[21]。

按照公式计算糖酸比、Vc保存率、叶绿素保存率：

(2)

(3)

(4)。

1.3.3.4 抗氧化物酶活性测定 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性的测定分别采用邻苯二酚比色法和愈创木酚比色法[22]。

1.3.3.5 菌落总数的测定 测定方法参照《GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[23]。根据公式计算杀菌率[24]：

杀菌率=

(5)。

1.3.4 特征指标的筛选及最优工艺参数的确定 将响应面试验数据进行相关性分析，在此基础上利用主成分分析(principal component analysis,PCA)提取猕猴桃浊汁的理化特征指标，建立理化特征指标和杀菌率的二次方程回归模型，分析影响各指标的主次因素及因素间的交互作用[25]。通过综合优化得出热辅助超声波处理猕猴桃浊汁的最佳工艺参数，其中各指标综合的权重计算采用熵权法[26]确定。

1.3.5 数据分析 采用SPSS 20.0软件进行相关分析及PCA；使用Design Expert 10设计三因素三水平响应面试验、进行数据分析、建立回归方程，显著水平设置为0.05。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果

猕猴桃浊汁杀菌试验的设计与试验结果见表2。表中1～17号是响应面设计的17组杀菌条件所得样品的测定值，18号是未处理样品测定值。

2.2 猕猴桃浊汁理化特征指标提取

杀菌是果汁加工生产中的重要环节，因此选取杀菌率作为优化工艺参数的主要指标之一。对表2，表3中的pH、浊度(nephelometric turbidity unit,NTU)、TA含量、L*、a*、b*、△E、褐变度(degree of browning,DB)、Vc保存率、糖酸比、TSS含量、总酚含量、可溶性糖含量、叶绿素保存率、POD活性、PPO活性16个指标进行相关性分析，结果见表4。

表2 猕猴桃浊汁杀菌试验设计与结果Table 2 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

表3 猕猴桃浊汁杀菌试验设计与结果Table 3 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

由表4可知，16个指标的相关性较高，可利用变量相关性合理分组的主成分分析法减少变量个数，提取理化特征指标，其中PPO和POD活性与猕猴桃果汁的外观品质、营养物质相关性高，因此，可将这两种酶与其他理化指标一起进行特征提取。

表4 16项指标的相关性分析Table 4 Correlation coefficient of 16 indices

图1为对16个评价指标进行主成分分析时的成分特征值贡献碎石图，图中越陡峭的线段对应的成分对变异贡献率越大，反之则越小。可以看出，前4个成分曲线陡峭，第5个成分之后曲线斜率明显增大。表5为主成分分析解释总变量，前4个成分的累计方差贡献率达到78.787%，表明这4个成分表达了猕猴桃浊汁理化指标的绝大多数信息。因此，可以将评价猕猴桃浊汁的理化指标压缩为4个主成分。

表5 成分分析解释总变量Table 5 Total variance explained of component analysis

由表6可知，成分1中代表性指标有叶绿素保存率、POD活性、pH、TA、Vc保存率，体现了猕猴桃汁的热敏性成分保存率和酸味特征，其中叶绿素保存率的权重最大(0.881)，叶绿素保存率与pH、POD活性、Vc保存率之间呈显著相关，因此可选取叶绿素保存率作为成分1的特征指标；成分2中代表性指标有PPO活力、DB、NTU、a*值，体现了猕猴桃汁的外观特征和贮藏品质，其中PPO活性权重最高(0.928)，PPO活性与NTU、DB之间呈极显著相关，可选取PPO活性作为成分2的特征指标；成分3中代表性指标有△E值与b*、L*，体现了猕猴桃汁的色泽特征，其中△E值权重最高(0.958)，△E值与b*值、L*值均呈极显著负相关，可选取△E为成分3的特征指标；成分4的代表性指标有TSS、可溶性糖含量、总酚含量、糖酸比，体现了猕猴桃浊汁的风味特征，虽然TSS的权重最高(0.886)，但考虑到糖酸比能更好地反映猕猴桃浊汁的风味特征，且糖酸比与TSS、可溶性糖含量均呈极显著正相关，因此选择糖酸比作为成分4的特征指标。综上所述，筛选出的评价猕猴桃浊汁的理化特征指标为叶绿素保存率、PPO活性、△E值及糖酸比。

表6 旋转成分矩阵Table 6 Rotated component matrix of factor analysis

2.3 响应面回归模型的建立与分析

采用Design-Expert软件进行数据分析，建立回归模型，可分别得到猕猴桃浊汁的叶绿素保存率(Y1)、PPO活性(Y2)、△E值(Y3)、糖酸比(Y4)和杀菌率(Y5)与热辅助超声波处理工艺条件之间的多项式模型，其中A、B、C为编码自变量：

Y1=26.79-2.36A-14.86B-4.48C+7.08AB+4.25AC-0.94BC-11.98A2+15.85B2+10.19C2

(10)

Y2=37.18+0.14A-6.47B+1.10C+14.27AB+15.78AC+2.24BC+37.53A2-13.26B2+0.08C2(11)

Y3=2.85-0.65A+1.04B-0.14C+0.21AB+2.02AC-1.36BC+1.99A2+2.27B2-0.004C2

(12)

Y4=6.38-0.11A-0.19B+0.21C+0.49AB+0.06AC-0.38BC

(13)

Y5=81.47+6.28A+28.50B+9.73C-3.69AB-0.81AC-4.14BC-6.17A2-11.60B2-6.47C2

(14)

由表7可知，各指标失拟项均不显著，建立的模型均显著，表明回归方程可信度高，可用于试验结果的预测。各参数对叶绿素保存率的影响大小顺序依次是B>C>A，B和B2对叶绿素保存率影响极显著，A2和C2影响显著；对PPO活性的影响大小顺序依次是B>C>A，A2对PPO活性影响极显著，AB、AC和B2对PPO活性影响显著；对ΔE值影响的大小顺序依次是A>C>B，B2和C2对ΔE值的影响极显著，A和A2影响显著；对糖酸比影响的大小顺序依次是C>B>A，AB对糖酸比影响极显著，C、BC和B2影响显著；对杀菌率影响的大小次序依次是B>C>A，B、C和B2对杀菌率影响极显著，A影响显著。

表7 叶绿素保存率、PPO活性、△E值、糖酸比、杀菌率的回归方程系数显著性检验结果Table 7 Test of significance for regression equation coefficients of ratio of preservation rate of chlorophyll,activity of PPO,ΔE value,the ratio of sugar to acid,antibacterial rate

2.4 参数间交互作用分析

采用Design-Expert软件进行数据分析，响应曲面图可以直观表现出各参数之间交互作用，抛物面越明显，则参数之间的交互作用越强；反之则越弱。

图2是超声时间为17.5 min时，PPO活性与超声功率和温度的交互作用曲面图。随着超声功率的增大，PPO活性呈先减小后增大的趋势。这是由于当超声功率小于450 W时，随着超声功率的增加，空化作用、热效应和机械作用增强，灭酶效果增强，当超声功率过高时，高强度超声波易在超声波探头周围形成稠密的空化云，阻碍了能量的传播，灭酶效果反而越差[27]。

图2 超声功率与温度交互作用对PPO活性的响应面图Fig.2 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on activity of PPO

图3是温度为42.5℃时，PPO活性与超声功率和超声时间的交互作用曲面图。当选用较低超声功率及固定温度时，随着超声时间的延长，空化作用时间延长，使得空化效果及灭酶效果更佳，PPO活性呈现减小的趋势；当选用较高超声功率时，由于空化效果较强，随着超声时间的延长空化效果更强，导致PPO的分子结构改变，提高了PPO活性，灭酶效果变差。

图3 超声功率与超声时间交互作用对PPO活性的响应面图Fig.3 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time on activity of PPO

图4是超声功率为450 W时，糖酸比与超声时间和温度的交互作用曲面图。随着温度升高，超声时间增加，猕猴浊汁糖酸比呈现增大的趋势。这是由于超声时间的延长对细胞破坏程度加大，细胞呼吸速率加快，一方面果实内不溶性淀粉转化为可溶性糖；另一方面加速了有机酸的TAC循环和糖异生，使有机酸被转化为糖或被氧化，致使TA含量减少[28]，这与张琪等[29]的研究结果一致。

图4 超声时间与温度交互作用对糖酸比的响应面图Fig.4 Response surface plots of the interaction of ultrasonic time and temperature on ratio of sugar to acid

图5是超声时间为17.5 min时，糖酸比与温度和超声功率的交互作用曲面图。当超声时间一定时，随着温度的升高，超声功率的增大，糖酸比先减小后增大，这可能是由于温度较低和超声功率较小时，热辅助超声波处理对细胞破坏程度小，仅使得细胞内有机酸释放量增大，产生更多可滴定酸，而未能达到加速细胞呼吸的程度，可滴定酸消耗速率不变，整体表现为猕猴桃浊汁可滴定酸含量增大，糖酸比减小；当温度和超声功率增大时，细胞呼吸作用显著增强，有机酸被大量消耗，从而使糖酸比增大，其中可滴定酸的变化趋势与曾祥媛等[30]的研究结果一致。

图5 超声功率与温度交互作用对糖酸比的响应面图Fig.5 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on ratio of sugar to acid

2.5 热辅助超声波处理猕猴桃浊汁最佳工艺参数的确定及验证

将表2和表3中1～17组样品的杀菌率及理化特征指标的数据进行标准化处理，根据标准化矩阵计算得出的信息熵和熵权如表8所示，可得出5个指标的权重比近似为2∶2∶4∶1∶2。

结果表明，叶绿素保存率越高，浊汁色泽越佳，外观品质越好，同时，叶绿素是热敏性物质，猕猴桃汁叶绿素保存率越高，其他热敏性物质的保存率也相对越高。PPO是催化果蔬酶促褐变的关键酶，PPO活性与果蔬褐变程度相关，PPO活性较低时，能有效抑制褐变的发生[31]。ΔE值越小说明处理后的浊汁与鲜样色差越小，色泽保持度越高。糖酸比代表猕猴桃汁的风味特征，数值过大表示风味偏甜，味道单调，数值过小表示口感过酸，食用品质差[32]。糖酸比为5～7的猕猴桃果汁酸甜可口[33]。

因此，以杀菌率最高、ΔE值最小、糖酸比为5～7、叶绿素保存率最高、PPO活力最小作为优化目标，并根据指标权重比将5个指标的权重分别设为2、2、4、1、2，应用软件的综合优化功能，对热辅助超声处理猕猴桃汁的工艺参数进行优化，得到最佳工艺参数为：超声功率422.14 W、超声时间30 min、温度59.99℃。考虑到实际条件，调整为：超声功率420 W、超声时间30 min、温度60℃。在此工艺参数下处理的猕猴桃汁的试验结果见表9。

表9 回归方程预测效果表Table 9 Prediction effect of regression equation

由表9可知，在此工艺参数下理化特征指标和杀菌率的测定值与预测值的相对误差均小于5%，表明建立的回归模型可信度高，可用于热辅助超声波处理猕猴桃浊汁各项指标的预测。

3 讨论

3.1 热辅助超声技术对猕猴桃浊汁的杀菌效果

最佳工艺条件下热辅助超声波对猕猴桃浊汁的杀菌率为95.68%，这与Nayak等[34]的研究结果一致。最佳工艺参数下，猕猴桃浊汁的菌落总数为27.2 CFU·mL-1，符合国家饮料食品卫生标准GB 4789.2-2016的要求 (≤100 CFU·mL-1)[23,35]。热辅助超声波技术具有“热效应”和“非热效应”双重杀菌作用，杀菌效果显著。超声波主要通过的空化作用进行杀菌，大量气泡在液体媒质中产生，运动中产生较大剪切力，同时在气泡破裂瞬间形成局部的高温高压，微生物的细胞结构被破坏，导致细胞溶解[36]。热辅助超声波各参数对杀菌率的影响由大到小依次是温度(B)>超声时间(C)>超声功率(A)，3个参数对杀菌率均有显著影响。随着温度的升高，超声杀菌效果增强，这可能是因为在温度升高的过程中，细胞膜流动性增强，导致细胞膜更易破裂，杀菌效果增强。而超声功率增大，超声时间延长都会增强超声波的空化效果，进而提高杀菌率。

3.2 热辅助超声技术对猕猴桃浊汁理化特征指标的影响

在果蔬汁中由于酶的作用，营养物质被分解，外观品质变差。POD与果蔬褐变和异味产生密切相关，是果蔬成熟和衰老的生理指标。本研究结果表明，热辅助超声波处理后的猕猴桃浊汁POD活性与未处理样品相比有所降低(表2、表3)，说明热辅助超声处理可以抑制POD活性。POD具有热稳定性，通常当温度达到80℃，POD才会完全失活。本研究发现，猕猴桃浊汁POD活性与叶绿素保存率、Vc保存率呈显著正相关(表4)。这可能是因为高温会降低POD活性，但同时也会破坏叶绿素和Vc等热敏性成分。因此为了避免因高温引起的营养物质及外观品质的变化，不能将POD彻底灭活。PPO在有氧条件下与酚类物质发生反应，酚类物质被氧化成醌类物质，再通过一系列脱水-聚合反应，最终形成黑褐色物质，发生酶促褐变[37]。热辅助超声波对酶的作用机理较复杂，主要通过空化作用改变酶的结构从而抑制酶的活性[38]。

热辅助超声处理能够较好地保持猕猴桃汁的风味物质和外观品质。与未处理样品相比，热辅助超声处理的猕猴桃汁糖酸比有不同程度地增大，但均在5～7之间，在最佳工艺条件下，糖酸比为6.17，果汁酸甜可口，风味口感好，热辅助超声波技术可用于猕猴桃浊汁的加工。在最佳参数下，猕猴桃浊汁△E值为4.43，叶绿素保存率为30.99%，与未处理样品差异较大。叶绿素在pH值为3.3左右的浊汁中很不稳定，且耐热性差，高温处理使得叶绿素分解，导致猕猴桃浊汁绿色变浅。

4 结论

猕猴桃浊汁的理化特征指标为叶绿素保存率、糖酸比、△E值、PPO活性，建立的猕猴桃浊汁的理化特征指标及杀菌率的回归方程模型具有统计学意义(P<0.05)，可用于分析和预测热辅助超声处理参数对猕猴桃浊汁理化特征指标及杀菌率的影响；热辅助超声处理猕猴桃浊汁的最佳工艺条件为：超声功率420 W、超声时间30 min、温度60℃，在此工艺条件下对猕猴桃浊汁进行处理，猕猴桃汁的杀菌率为95.68%、△E值为4.43、糖酸比为6.17、叶绿素保存率为30.99%、PPO活性为19.48 U·mL-1。热辅助超声波处理猕猴桃浊汁具有污染少，安全性好，无毒副作用等优点，处理后的猕猴桃浊汁杀菌率高，品质较好，结果表明热辅助超声波技术可用于猕猴桃浊汁的加工。