一种检测KPC和NDM耐药基因的双重PCR-LF方法建立及初步应用*

王 洁,裴 兵,孙 宁,王卫萍，王 颖，李晓军△

1.南京医科大学附属宿迁第一人民医院中心实验室，江苏宿迁 223800；2.东部战区总医院临床中心实验科，江苏南京 210002

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用,耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)逐年增多[1]，给感染的治疗带来了极大的挑战[2]。在CRE的耐药机制中，最主要是产碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属β-内酰胺酶(NDM)是目前研究最多也最为常见的碳青霉烯酶。目前，采用常规实验室的药敏试验方法指导临床用药，存在着培养时间过长的缺点，严重影响了临床治疗时效性。为了适应临床治疗对快速检测的需求，低成本、快速的侧流层析(LF)技术得到进一步发展[3]。本研究将双重聚合酶链反应(PCR)技术和LF技术有机结合，建立双重PCR-LF方法检测2种重要碳青霉烯酶基因(KPC和NDM)，实现在一个反应体系中快速、特异地检测2个靶标基因，并将该方法直接用于临床无菌体液标本的检测，为早期指导临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 携带KPC、NDM肺炎克雷伯菌，产KPC-2的碳青霉烯类抗菌药物耐药标准肺炎克雷伯菌菌株ATCCBAA-1705，携带blaIMP的铜绿假单胞菌，携带blaVIM的恶臭假单胞菌，携带blaNDM-1的肺炎克雷伯菌均由东部战区总医院中心实验科微生物室保存。

1.2仪器与试剂 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)； PCR分析试剂盒(Takara公司)和DL2000 DNA标记物(Takara公司)；TIANamp Blood DNA 检测试剂盒(天根生物科技有限公司)；核酸染料GelRed(美国Biotium公司)。PCR扩增仪(美国BioRad公司)、电泳仪(美国BioRad公司)；凝胶电泳成像分析系统(上海欧翔科学仪器有限公司)；高速离心机(Eppendorf5417R)；VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)；微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 将细菌接种于MH琼脂平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100 μL灭菌去离子水，100 ℃ 10 min，12 000×g离心5 min，转移上清液至—20 ℃保存备用。无菌体液标本DNA按照试剂盒说明书进行提取。

1.3.2引物 根据GenBank已发表的序列[4-6]，设计KPC、NDM引物。引物序列由上海Invotrigen公司合成。

1.3.3双重PCR 扩增体系(25.0 μL)：Premix Ex Tap Hot Start Version 12.5 μL，2种耐药基因(KPC、NDM)的正向和反向引物(10 μmol/L)各加0.5 μL至同一反应体系，1.0 μL DNA模板，加ddH2O补足至25.0 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s,55～60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共计35个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；72 ℃ 10 min。取产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行测序验证。

1.3.4双重PCR方法学评价 将携带KPC、NDM的肺炎克雷伯菌，按照上述1.3.1步骤进行DNA提取后，检测其水平，进行10倍梯度稀释，按照建立的双重PCR反应体系进行检测。

1.3.5LF试纸的制备与性能测试 以半抗原地高辛、荧光素与相应抗体的免疫反应为基础，制备LF试纸。在双重PCR检测KPC和NDM的研究基础上，将上述KPC和NDM引物进行标记(KPC上下游引物分别标记生物素和地高辛；NDM上下游引物分别标记生物素和荧光素)，扩增带有双标记的DNA产物，电泳后回收产物，利用NanoDrop-1000检测其水平；而后进行LF试纸的性能测试，以1 ng的双标记DNA产物为测试模板，首先分析不同抗体水平的检测效果，两条检测线：T1为抗地高辛抗体，T2为抗荧光素抗体，质控线C为生物素化的牛血清清蛋白(B-BSA)。

1.3.6双重PCR-LF检测KPC和NDM 采用双重PCR-LF检测标准菌株和临床分离菌株中的KPC和NDM基因。取双重/单重PCR产物5 μL点样在层析试纸条上，5～10 min后进行结果判读。

1.3.7应用双重PCR-LF检测临床标本 收集临床微生物送检无菌体液标本120份(包括脑脊液、穿刺液、关节液、引流液等)，进行DNA提取。按照上述建立起来的反应体系，进行双重PCR-LF检测。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计分析。将双重PCR-LF的检测结果与耐药表型结果进行配对比较，采用McNemar检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1双重PCR检测KPC和NDM方法学评价 双重PCR检测KPC和NDM的检测限为200 CFU/mL，与常规单重PCR检测结果一致，见图1。

注：A为双重PCR结果；B为常规PCR扩增KPC；C为常规PCR扩增NDM；M为DL1000 DNA 标记物；7～1为梯度稀释的产KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL) 。

2.2LF试纸的性能测试 LF试纸的性能测试结果表明，抗地高辛抗体、抗荧光素抗体和B-BSA的点样水平分别为250、50、50 ng时效果最佳，见图2。

图2 不同抗体水平对检测双标记DNA的影响

2.3双重PCR-LF检测KPC和NDM方法学评价 双重PCR-LF检测KPC和NDM，最低可检测到200 CFU/mL的肺炎克雷伯菌，并且与其他超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因没有交叉反应，见图3。

注：7～1为梯度稀释的产KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL)；A为双重PCR-LF检测结果；B为单重PCR-LF检测KPC的结果；C为单重PCR-LF检测DNM的结果。

2.4双重PCR-LF与药敏表型检测结果比较 以药敏表型为参考方法，双重PCR-LF检测的灵敏度为69.39%，特异度为92.96%，Kappa值为0.644，两种方法结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 双重PCR-LF与药敏表型检测结果比较(n)

3 讨 论

据2017年全国细菌耐药监测报告显示，在临床常见细菌感染中，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物(对亚胺培南、美罗培南或厄他培南任意一种药物耐药)的耐药率分别为1.5%、9.0%、20.7%和56.1%。就江苏省而言，碳青霉烯类抗菌药物耐药率高于全国平均水平，这一现象对当地居民的健康和感染控制造成了严重威胁[7-10]。因此，迫切需要建立一种快速、准确的碳青霉烯酶基因检测方法，指导临床用药，缩短TAT时间，避免抗菌药物的滥用，预防产碳青霉烯酶细菌暴发性感染。

常规微生物实验室多采用药敏表型检测的方法指导抗菌药物使用，需要进行细菌分离培养，整个检测流程时间较长，且易产生假阴性[11]，易延误治疗。多重PCR可一次扩增多种耐药基因，提高检测效率同时降低检测成本，减轻患者负担[5]。然而多重PCR仍存在一定不足，例如：常规的多重PCR技术需采用电泳或测序进行产物分析，实时荧光PCR技术需要配有荧光检测通道的PCR仪器，存在着操作烦琐、易污染等问题，且需要严格的操作流程和实验环境要求。

本研究将双重PCR检测方法和LF技术相结合。LF技术主要分为两类，一类是以碱基互补配对原则为反应基础的核酸LF技术(NALFT)；另一类是以免疫反应为基础的LF技术(NALFIA)，即在双链DNA上标记半抗原或生物素，而后利用生物素-亲和素反应或半抗原-抗体的免疫反应，以胶体金或量子点等作为标记物，进行核酸检测，实现快速、准确、可视化的检测需求。

本研究建立的双重PCR-LF方法直接用于无菌体液标本的检测，结果显示，LF试纸能够快速有效检测到耐药基因KPC和NDM，与药敏表型检测结果的Kappa值为0.644，一致性较好，且灵敏度达69.39%，特异度达92.96%，可为临床用药提供依据。但是本研究发现，部分无菌体液标本的药敏表型为耐药表型，但双重PCR-LF方法检测结果为阴性。分析原因：一是细菌的耐药方式并不仅局限于产碳青霉烯酶[12]；二是本研究建立的方法不能包含全部的碳青霉烯酶基因。但是随着细菌耐药机制研究的不断深入，发现KPC和NDM是较为常见和分布较广的碳青霉烯酶[2,13-14]。因此，从一定程度上讲，多重PCR-LF可以满足临床检测碳青霉烯酶基因的需求。

综上所述，本研究建立的双重PCR-LF方法检测时间约为3 h，且灵敏度、特异度均达到较高水平，实现了碳青霉烯酶基因的快速检测，可在临床药敏结果出来之前，指导临床用药，避免抗菌药物的滥用。同时，该检测方法也为今后在一个反应体系纳入3种及以上的耐药基因检测方法提供了思路与基础。