雷替曲塞联合阿帕替尼对结肠癌细胞增殖的影响及其机制

张强，邢迎清，王朝阳，贺许良

1 天津市北辰医院普外科，天津300400；2 长沙医学院附属株洲市人民医院普外科

结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来，随着人民生活水平提高和生活方式转变，我国结肠癌的发病率逐年上升。目前，手术切除仍然是结肠癌最重要的治疗方式。但结肠癌早期症状不明显，大多数患者出现典型症状就诊时已处于中晚期，单纯手术治疗效果并不理想，通常需要联合放化疗或免疫治疗。雷替曲塞是一种抗代谢类叶酸类似物，因能特异性与水溶性胸苷酸合成酶(TS)结合，通过抑制肿瘤细胞DNA合成控制肿瘤细胞的生长、增殖，在中晚期食管癌、胃癌和结直肠癌等恶性肿瘤中取得了一定治疗效果[1]。阿帕替尼是我国第一个拥有自主知识产权的小分子靶向抗癌药物，能够通过抑制肿瘤组织血管生成而抑制肿瘤生长[2]，已被国家食品药品监督管理总局批准用于晚期胃癌的二线治疗[3]。但鲜见雷替曲塞联合阿帕替尼治疗结直肠癌的基础和临床研究。2020年5月—2021年1月，本研究探讨了雷替曲塞联合阿帕替尼对结肠癌细胞增殖的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞SW480(以下称SW480细胞)，购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。雷替曲塞，购自南京正大天晴制药有限公司；阿帕替尼，购自江苏恒瑞医药股份有限公司。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。MK3型酶标仪，购自美国Thermo Electron公司；CFX96型实时荧光定量PCR仪，购自美国Bio-Rad公司。cDNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人Bax、Caspase-3、Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人GAPDH单克隆抗体和羊抗小鼠二抗，购自英国Abcam公司。

1.2 细胞传代培养 从液氮中迅速取出SW480细胞冻存管，立即置于37 ℃水浴箱中快速解冻。待充分融化后，用移液枪反复吹打使细胞充分混匀，将细胞悬液接种于含10% FBS的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长融合80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，10% FBS终止消化后按1∶3传代。取传3代、对数生长期、生长状态良好的SW480细胞进行后续实验。

1.3 细胞分组干预 将SW480细胞接种于96孔板，每孔3×103个，随机分为对照组、雷替曲塞0.5 μg/mL组、雷替曲塞1.0 μg/mL组、雷替曲塞1.5 μg/mL组、阿帕替尼组和联合干预组，每组设5个复孔。雷替曲塞0.5、1.0、1.5 μg/mL组分别加入含0.5、1.0、1.5 μg/mL雷替曲塞的DMEM培养液，阿帕替尼组加入含1.5 μg/mL阿帕替尼的DMEM培养液，联合干预组加入含1.5 μg/mL雷替曲塞和1.5 μg/mL阿帕替尼的DMEM培养液，对照组加入等量DMEM培养液，各组分别于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育48 h。

1.4 细胞增殖活性检测 采用MTT法。各组分别于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物完全溶解。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，并计算细胞增殖抑制率。以OD450值代表细胞增殖活性，细胞增殖抑制率(%)=(1-观察组OD450值/对照组OD450值)×100%。

1.5 Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。各组分别于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育48 h，收集细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按cDNA反转录试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，按实时荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：Bax上游引物5′-TCCTTCCAGCCTGAGAGCAAC-3′、下游引物5′-GCGACGGTAGCGACGAGAG-3′，Caspase-3上游引物5′-GTGGAACTGACGATGATATGGC-3′、下游引物5′-CGCAAAGTGACTGGATGAACC-3′，Bcl-2上游引物5′-TCATGTGTGTGGAGAGCGTC-3′、下游引物5′-AGCCTCCGTTATCCTGGATC-3′，内参GAPDH上游引物5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′、下游引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR反应体系共50 μL：SYBR Green Ⅰ荧光染料10 μL，cDNA模板5 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶1 μL，ddH2O补足至50 μL；反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min共40个循环，最后72 ℃ 7 min。PCR反应结束后绘制熔解曲线，收集循环阈值(CT)数。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.6 Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。各组分别于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育48 h，收集细胞，用预冷的PBS冲洗3次，RIPA裂解液充分裂解，12 000 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，提取细胞总蛋白。经BCA法蛋白定量合格后，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液100 μL，充分混匀，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白15 mg，10% SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Bax、Caspase-3、Bcl-2、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗涤5 min×4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤5 min×4次，ECL发光，暗室内曝光、显影，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖活性和细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组细胞增殖活性和细胞增殖抑制率比较

2.2 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达比较 见表2。

表2 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA相对表达量比较

2.3 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达比较 见表3。

表3 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较

3 讨论

近年来，我国结肠癌的发病率逐年上升，已位居恶性肿瘤的第三位[4]。结肠癌早期症状不明显，临床亦缺乏有效的早期筛查手段，大多数患者出现典型症状就诊时已处于中晚期。而对于中晚期结肠癌，单纯手术治疗效果不理想，通常需要联合放化疗、免疫治疗等来延长患者生存期。传统化疗药物，如奥沙利铂、卡培他滨、氟尿嘧啶，靶向性差，在杀伤肿瘤细胞的同时，也无差别地杀伤正常细胞，特别是造血细胞，导致机体免疫力下降，易诱发感染甚至其他严重并发症[5]。此外，肿瘤细胞普遍存在的耐药性也是影响化疗药物疗效的重要原因。随着分子肿瘤学迅速发展，肿瘤研究逐渐从细胞水平上转移到分子水平上，在肿瘤特异性靶蛋白或信号通路上寻找新的作用靶点成为近年来的研究热点。

雷替曲塞是一种高特异性、高选择性的TS抑制剂，在临床上被普遍用于结肠癌的辅助治疗[6]。雷替曲塞通过细胞膜外的还原型叶酸载体转移至细胞内，然后迅速被叶酸基聚谷氨酸盐合成酶代谢成聚谷氨酸盐，并以聚谷氨酸盐的形式贮存于细胞内，而聚谷氨酸盐通过增强TS抑制能力、延长抑制时间而提高其抗肿瘤活性。阿帕替尼是一种可以口服的小分子抗血管生成靶向药[7]。血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤血管生成和肿瘤组织生长必不可少的细胞因子，在肿瘤细胞迁移过程中发挥重要作用[8]。阿帕替尼具有高选择性地与肿瘤细胞内VEGF的ATP结合位点竞争性结合，阻断向下游传递信号，抑制其自动磷酸化，使新生的肿瘤血管逐渐退化，从而阻止肿瘤新生血管形成，继而抑制肿瘤的生长、扩散或转移[2]。有研究报道，阿帕替尼对胃癌细胞增殖具有显著地抑制作用，对结直肠癌细胞增殖亦具有一定抑制作用，并且呈浓度依赖性[7]。此外，阿帕替尼还能长时间在细胞内停留，进而使TS活性被长久抑制，最终导致肿瘤细胞DNA破裂而死亡[9]。本研究结果发现，雷替曲塞和阿帕替尼均能抑制SW480细胞增殖，且随着雷替曲塞浓度升高，其增殖抑制作用逐渐增强，呈浓度依赖性。Ⅰ、Ⅱ期临床试验表明，阿帕替尼对结直肠癌有一定治疗效果。本研究结果亦证实，阿帕替尼能够抑制结肠癌细胞增殖，这与Ⅰ、Ⅱ期临床试验结果相符。

细胞凋亡是一种为了维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主性、有序性死亡[10]。线粒体、死亡受体、内质网均参与细胞凋亡过程，而线粒体是细胞凋亡的调控中心。Bcl-2家族广泛分布于线粒体外膜，其家族成员是细胞凋亡的关键调节因子。其中，Bcl-2是抗凋亡因子，具有保护细胞的功能，能够阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命；Bax是促凋亡因子，具有破坏细胞的功能，能够促进细胞凋亡。Bcl-2/Bax能够决定细胞凋亡的走向，被称为“凋亡开关”。正常情况下，Bcl-2和Bax处于一种相对平衡的状态，当Bax占优或Bcl-2受到抑制时，可引起线粒体功能紊乱，促进细胞色素C从线粒体中释放出来，进而导致由线粒体途径介导的细胞凋亡；反之，Bcl-2占优或Bax受到抑制时则细胞存活[11]。细胞凋亡过程是蛋白经过连续不断的水解反应完成，任何细胞的凋亡都要经过Caspase家族来实现。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，是细胞凋亡的关键介质[12]。有研究表明，凋亡信号释放后刺激肿瘤细胞，在Bcl-2占优的情况下线粒体功能出现紊乱，线粒体内细胞色素C转移至细胞质，在dATP存在的条件下与凋亡相关因子1结合形成凋亡复合体，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能够进一步激活Caspase-3，而Caspase-3能够将作用于细胞构造、细胞周期、细胞DNA修复有关的蛋白或激酶杀死，使细胞发生凋亡[13]。有研究报道，MSI-H结肠癌细胞经雷替曲塞干预后，促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表达显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低[14-15]。本研究结果发现，经雷替曲塞和阿帕替尼干预后，SW480细胞Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量逐渐升高，而Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量逐渐降低，以联合干预组变化更明显。提示雷替曲塞和阿帕替尼抗肿瘤作用的机制可能与调控Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA和蛋白表达，从而促进结肠癌细胞凋亡有关。

综上所述，雷替曲塞联合阿帕替尼能够抑制人结肠癌细胞增殖，其效果优于雷替曲塞或阿帕替尼单独用药，其作用机制可能与调控Bax、Caspase-3、Bcl-2表达，促进肿瘤细胞凋亡有关。