miR-135b-5p在口腔鳞状细胞癌中的表达及相关生物信息学分析

赵格，黎昌学，郭超，朱慧

石河子大学医学院第一附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区 石河子（832000）

口腔癌为全球第九大恶性肿瘤，约90%以上的口腔癌是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），虽然近年来治疗OSCC的手术和放化疗技术有了一定进步，但5年生存率仍仅为50%左右［1］。随着分子生物学的发展，越来越多的研究显示微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤细胞的生长、分化、增殖和凋亡等过程中发挥了重要的作用［2］。miR-135b-5p在胰腺癌［3］、胃癌［4］、结直肠癌［5］等恶性肿瘤中异常高表达，但miR-135b-5p在OSCC中的表达情况尚不明确。本研究通过对公开发表的转录组测序数据、基因芯片数据进行分析，辅以新鲜组织样本实验验证，探讨miR-135b-5p在OSCC患者中的表达水平及其与临床特征的关系。同时采用生物信息学方法预测miR-135b-5p的靶基因并进行通路富集分析。

1 资料和方法

1.1 研究资料

肿瘤与癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）中下载与OSCC相关的miR-135b-5p表达数据（247例癌组织，17例癌旁组织）及其完整的临床资料（222例）；与OSCC相关的mRNA表达信息（240例癌组织，17例癌旁组织）。基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载OSCC相关基因表达谱数据GSE45238（40例癌与癌旁配对组织）。收集石河子大学医学院第一附属医院2017年1月至2020年6月手术切除的30例口腔鳞癌组织和癌旁组织（距癌组织边缘≥2 cm）。所有OSCC患者手术前均未接受放疗或化疗。所有手术取材标本离体后立即放置在液氮中，后储存在-80℃冰箱中。本研究由石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准（文件编号：AF/SC-08/01.0），本研究收集的标本已取得患者的书面知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 公共数据库中miR-135b-5p表达分析 TCGA、GEO官网下载OSCC组织及癌旁组织中miR-135b-5p原始表达数据，标准化处理后行差异分析。将miR-135b-5p表达信息与临床信息合并，用于后续临床相关性分析。使用R语言edgeR包筛选出TCGA下载的mRNA表达谱中的差异表达的mRNA。

1.2.2 新鲜组织中miR-135b-5p表达分析 依据Biospin miRNA Extraction Kit试剂盒说明完成组织中miRNA提取，测量OD260/280值在1.8～2.0之间。使用miRNA ALL-IN-One cDNA Synthesis Kit将总miRNA反转录成cDNA。以U6为内参（表1），使用EvaGreen miRNA qPCR Master Mix-Low ROX试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）。扩增反应条件如下：预变性95℃10 min，1个循环；变性95℃10 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，40个循环。所有反应均设置3个复孔以减少加样等造成的误差影响实验结果。扩增反应结束后分析溶解曲线，判断扩增产物是否存在非特异性扩增。分析扩增曲线，采用2-△△Ct计算miR-135b-5p在OSCC组织中的相对表达量。

表1 miR-135b-5p的实时荧光定量PCR扩增引物序列Table 1 Primer sequence of miR-135b-5p qRT-PCR amplification

1.2.3 miR-135b-5p靶基因预测及功能富集分析 从miRTarBase、targetScan和miRDB三个数据库预测miR-135b-5p的靶基因，选取至少2个数据库中预测到的靶基因与TCGA数据库下载分析的差异mRNA取交集。通过R语言对这些交叉基因进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2.4 miR-135b-5p关键靶基因筛选 通过STRING数据库绘制蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI）用于揭示靶基因之间的关系，置信度参数为0.400。使用Cytoscape3.6.1及其插件cytoHubba筛选出前10个关键靶基因。

1.3 统计学方法

使用R语言3.6.3及其附属包进行统计分析并绘图。两组间差异采用Wilcoxon检验。卡方检验分析miR-135b-5p表达情况与OSCC患者临床病理特征关系。通过受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析评价miR-135b-5p表达对于OSCC患者诊断的准确性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 miR-135b-5p在OSCC组织及癌旁组织中的表达差异

TCGA、GEO官网下载OSCC组织原始表达数据，以及本研究中新鲜组织中miR-135b-5p的qRTPCR结果的分析显示，OSCC组织中miR-135b-5p表达量高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）。见图1。

Figure 1 miR-135b-5p is frequently increased in oral squamous cell carcinoma cancer tissues图1 miR-135b-5p在口腔鳞状细胞癌组织中高表达

2.2 miR-135b-5p表达水平与临床病理关系

TCGA中下载与OSCC相关的miR-135b-5p表达数据及其完整的临床资料（222例），χ2检验表明miR-135b-5p表达水平与肿瘤组织病理分级相关（P＝0.011），但与年龄、性别、临床分期、淋巴结转移情况不相关（P＞0.05）（表2）。miR-135b-5p对OSCC具有较好的辅助诊断效能（AUC＝0.960，P＜0.001）（图2）。

表2 miR-135b-5p表达与临床病理相关性Table 2 miR-135b-5p expression associated with clinical pathological characteristics

2.3 miR-135b-5p靶基因预测及功能分析

3个软件预测的靶基因数分别为804、83、537，取任意两软件预测结果的交集（共503个）（图3）。为了进一步提高生物信息学分析的可靠性，与TCGA下载分析出的差异mRNA取交集，最终筛选出与miR-135b-5p表达相反的靶基因共60个。对60个靶基因进行KEGG通路富集研究，富集集中在与肿瘤相关的钙离子信号通路、cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路中（表3）（P＜0.05）。

表3 miR-135b-5p靶基因KEGG信号通路显著性富集分析结果Table 3 Significantly enriched KEGGpathways of target genes of miR-135b-5p

2.4 miR-135b-5p关键靶基因筛选

上述得到的60个预测靶基因中，共有35个被过滤到靶基因PPI网络中，筛选得到10个关键靶基因（图4），分别为大同源物2（discs-large homolog 2，DLG2）、锚蛋白重复序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）、Erb-B2受体酪氨酸激酶4（Erb-B2receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）、电压门控性钠通道二型beta亚单位（sodium channel voltage-gated type II beta，SCN2B）、蛋白激酶锚定蛋白（neurobeachin，NBEA）、γ-氨基丁酸β2亚基（γ-aminobutyric acid neurotransmitter receptor β2 subunit gene，GABRB2）、质膜钙ATP酶异构体2（plasma membrane calcium ATPase 2，ATP2B2）、α-互养蛋白（α-syntrophin，SNTA1）、钙电压门控通道亚单位α1D（calcium voltage-gated channel subunit alpha1 D，CACNA1D）、血影蛋白β非红细胞4（spectrin beta nonerythrocytic 4，SPTBN4）。

3讨论

OSCC的发生发展是一个多阶段、多步骤、多基因、多通路调控的复杂过程［6］。miRNA表达异常在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，深入研究miRNA与肿瘤的相关性将有望为肿瘤的诊断及靶向治疗提供新的思路。miR-135b位于1号染色体上，有miR-135b-5p和miR-135b-3p两种剪切成熟体［7］。miR-135b作为一种促癌因子，在多种肿瘤中均有着重要的作用，控制着癌细胞的生物学行为并影响耐药，如：高表达的miR-135b-5p可通过靶向NR3C2促进胰腺癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化［3］，可抑制胃癌细胞凋亡并诱导顺铂耐药［4］；抑制miR-135b的表达能够抑制结大肠癌细胞的增殖，提高患者对奥沙利铂的敏感性［8］，降低鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力［9］。

Figure 2 Receiver operating characteristic curve of miR-135b-5p in the diagnosis of oral squamous cell carcinoma图2 miR-135b-5p诊断口腔鳞状细胞癌的受试者工作曲线

Figure 3 Venn diagram of predicted target genes of miR-135b-5p图3 miR-135b-5p的预测靶基因数目韦恩图

目前miR-135b-5p在OSCC中的表达情况仍存在争议。有研究表明，微阵列实验结果显示miR-135b在OSCC中呈低表达；而另有研究证明miR-135b-5p在OSCC中呈高表达［10］。为了进一步明确miR-135b-5p在OSCC中的表达情况，本研究首先基于TCGA、GEO数据库大样本优势分析了OSCC组织中miR-135b-5p的表达情况，后辅以新鲜组织进行体外实验验证。实验结果均表明miR-135b-5p在OSCC组织中高表达，差异有统计学意义；且miR-135b-5p表达量对于OSCC具有良好的诊断效能。此外OSCC组织中miR-135b-5p表达与病理分级相关，低分化程度患者组织中miR-135b-5p表达量高于高中分化患者，差异具有统计学意义。Kademani等［11］发现每升高一个组织学等级，患者生存率降低44%，组织学等级是预测生存率的独立因素。研究表明低分化的细胞由于缺乏凝聚力，具有单细胞侵袭模式，随着细胞分化程度的降低，淋巴结转移的机会会增加［12］。因此笔者推测，作为诊断标志物的miR-135b-5p的高表达可能预示着不良预后。

Figure 4 Hub genes of protein-protein interaction network图4 蛋白互作网络的关键靶基因

miRNAs是转录后水平调控基因表达的关键分子。KEGG富集分析结果显示，miR-135b-5p的预测靶基因集中富集在与肿瘤密切相关的3个通路中：钙离子、cGMP-PKG、cAMP信号通路。这些通路都是与肿瘤增殖、分化、凋亡、侵袭、转移等生物学行为密切相关的信号通路［13-15］。这与前述的关于miR-135b-5p影响多种肿瘤细胞不良生物学行为和耐药的实验研究结论相一致［3-4］。构建蛋白互作网络，筛选出10个重要的中枢蛋白：DLG2、ANK3、ERBB4、SCN2B、NBEA、GABRB2、ATP2B2、SNTA1、CACNA1D、SPTBN4。其 中CACNA1D和ATP2B2均参与了上述3个癌症相关通路。乳腺癌中miR-135b低表达，ATP2B2高表达，ATP2B2减少了肿瘤细胞内钙离子进而抑制了细胞凋亡［16］。这与笔者预测的ATP2B2参与调控钙离子通路的结果一致。CACNA1D在肾癌和肺癌中均低表达［17］，前列腺癌中低表达的CANCA1D提示肿瘤的恶性程度更高，侵袭性更强［18］，有望成为癌症治疗的新靶点。本实验通过生物信息学分析，得到的miR-135b-5p的关键靶基因及癌症相关的靶向调控的信号通路，为后续机制研究提供方向。