全自动荧光免疫分析仪GSPTM检测新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活性性能及切值建立

李 霞 何 玲 罗业超 厉玉姣

湖南省长沙市妇幼保健院(410007)

我国葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症患病率0.2%～44.8%[1-3]。新生儿G-6-PD酶活水平是筛查G-6-PD缺乏症的唯一指标。但受外界等因素影响，检测结果存在明显的季节及实验室波动性。全自动新筛系统GSPTM是目前用于新生儿疾病筛查的全自动检测体系，与传统的检测平台(Wallca 1420)相比，显著提高了检测特异性，效能更优但尚缺少长沙地区筛查G-6-PD的切值。对于新项目性能的评估，行业内鲜有完备的性能验证方案。因此，评估GSPTM新筛系统性能并建立适用于本地区、本中心的筛查切值十分必要且迫切。本研究开展了GSPTM性能验证，确定长沙地区新生儿G-6-PD酶活筛查切值。

1 资料和方法

1.1 实验材料

已知浓度分别为3.7U/dl(A)、8.5U/dl(B)、17.4U/dl(C)、35.3U/dl(D)、76.3U/dl(E)和120U/dl(F)的试剂盒G-6-PD干血片标准品(亦用作线性样本)；浓度为15.67 U/dl(低浓度，SD=10%，允许偏移区间±3SD=10.78～20.02 U/dl)和58.55 U/dl(高浓度，SD=10%，允许偏移区间±3SD=41.79～77.61 U/dl)的试剂盒G-6-PD干血片质控品。新生儿干血片样本13767例及已确诊G-6-PD阳性样本29例。

1.2 实验方法

G-6-PD酶活检测实验于GSPTM仪器上完成(PerkinElmer,芬兰，型号2021)；试剂为GSPTM专用新生儿G-6-PD检测试剂，荧光酶法检测。

1.3 性能验证

1.3.1精密度检测3个标准品(B、D、E)酶活，各浓度标准品每天测量1个批次3次重复，共进行5天。获得各浓度标准品15个测量值，计算批内及批间变异系数(CV)。单次测量结果与总均值差异≥4倍标准差时，认为是离群值并删除。一批内只允许有1个离群值，否则不能使用该批数据。

1.3.2准确度对高浓度及低浓度质控品酶活进行测定。每个样本每天测量1个批次并重复5次，共进行5天，各浓度质控品获得25个测量值，计算25个测量值总均值(各浓度测量值之和)是否在允许偏移区间内。单次测量结果与总均值差异≥4倍标准差时，认为是离群值并删除。一批内只允许有1个离群值，否则不能使用该批数据。

1.3.3线性范围每个样本3次重复酶活测定，在随机选定的一批测量中完成。绘制线性样本的试剂测定值与参考值线性方程，评估测量均值与理论值的线性关系及线性范围。所选批次测试应进行室内质控，质控在控结果取用，反之亦然。

1.4 切值确立

通过仪器检测获得G6PD临床样本及阳性样本酶活结果，结合百分位数和ROC曲线分析，确立符合社会经济学效益、科室运行效力的筛查切值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 精密度

分析测定选定浓度的45个标准品酶活均未超出对应均值的4倍标准差。计算GSPTM检测体系批内变异系数分别为2.5%、3.0%和1.5%，均低于厂提供的3.4%；批间CV分别为3.1%、1.4%和0.8%，总CV分别为3.8%、3.1%和1.6%，均小于厂家3.9%(表1)。

表1 GSPTM筛查系统检测酶活精密度分析(U/dl)

2.2 准确度

测量25个低浓度和25个高浓度质控品酶活力值准确度分析见表2。低浓度质控总均值为15.67 U/dl，在允许偏移区间(10.78～20.02 U/dl)；高浓度质控总均值为58.55 U/dl，在允许偏移区间(41.79～77.61 U/dl)。各次测定结果与对应总均值差值均未超出4倍标准差。

表2 GSPTM筛查系统检测准确度分析

2.3 线性分析

测定所得线性样本浓度如表3所示。线性样本测量均值与理论值有极好相关性。其线性回归方程y=1.0612x-0.836，R2=0.999(图1)，大于试剂盒(R2≥0.995)，符合线性范围要求。

图1 GSPTM系统测定G-6-PD值与理论值线性分析

2.4 新生儿G-6-PD筛查切值

2.4.1线性相关分析比较临床样本检测结果，GSPTM测定值与传统1420检测平台测定值有显著线性相关性(图2)。两相关变量呈显著正相关，Spearson相关系数为0.999，P=0.000。

表3 GSPTM筛查系统线性范围检测

图2 新生儿G-6-PD值GSPTM与1420检测值分布散点图

2.4.2GSPTM筛查体系检测长沙新生儿G-6-PD酶活分布将GSPTM与传统1420检测平台测定的长沙地区新生儿G-6-PD酶活进行统计，并计算各浓度百分位数。结果表明1420检测平台测定G-6-PD P1.75浓度 2.1U/dl对应的GSPTM筛查系统为20.9U/dl。见表4。

表4 不同方法检测新生儿G-6-PD水平百分位数分布

2.4.3ROC曲线绘制应用13767例G6PD临床样本及29例G6PD阳性样本检测结果绘制ROC曲线。曲线下面积(AUC)为0.997(P<0.001,95%CI为0.996～0.998)(图3)。以约登指数最大时的G6PD测定值20.75为切值，其筛查灵敏度为100%，假阳性率为0。

图3 GSPTM筛查系统G-6-PD测定值ROC曲线图

3 讨论

作为较易受实验环境及人员因素影响的临床检测项目，新生儿G-6-PD缺乏症筛查一直面临着不同季节不同筛查阳性率、不同实验室筛查CV值、阳性率筛查效率及召回效率低下等问题的困扰。全自动荧光免疫分析仪GSPTM提供了一个规避环境及人员操作影响的可能。但项目开展前需对设备、试剂性能进行评估[4]，并基于前期研究基础重新确立本地区的筛查切值。本研究依据临床定量实验性能验证方案对GSPTM筛查系统检测G-6-PD酶活的精密度、正确度和线性范围进行评估，并结合运用百分位数法及ROC曲线分析确立了长沙地区新生儿G-6-PD筛查的切值。

通过检测选定的3个浓度标准品，分析计算GSPTM系统检测G-6-PD的精密度表明，检测批内及批间变异系数均小于厂家提供的指标，符合卫生部临检中心要求。通过检测高、低浓度质控品表明，GSPTM系统检测G-6-PD正确度较好。检测线性样本评估GSPTM系统检测G-6-PD线性范围表明，GSPTM系统检测G-6-PD的检测值和理论值有非常高的线性相关性，相关系数大于允许值。提示GSPTM系统检测G-6-PD在2.5～228U/dl范围内具有较理想的检测性能，GSPTM系统应用于新生儿G-6-PD筛查可行[5]。

GSPTM筛查系统检测G-6-PD酶活较之前设备试剂方法学有较大改进[6]。以血液体积为内参计算酶活力值提高了检测特异性。本研究表明GSPTM筛查系统测定的G6PD结果与传统设备1420测定结果具有显著线性相关性，两相关变量呈显著正相关，Spearson相关系数为0.999( P=0.000)；酶活分布百分位数提示同样的相关性倾向。

新生儿G-6-PD酶活切值的确立需要考虑科室筛查效率、召回效率及社会经济学效益。对比传统设备1420与GSPTM检测所得样本浓度百分位数，1420设备检测切值2.1U/dl对应的样本浓度百分位数为P1.75，此切值下科室的召回效率可满足召回需求，且项目整体具有较高的筛查效率。与该浓度对应的GSPTM系统检测样本浓度为20.9U/dl。以ROC曲线确定的筛查切值为20.75U/dl，结合29例阳性样本G-6-PD酶活浓度在0.2～18.0U/dl，只有1例患儿的初筛阳性结果为20.7U/dl的情况，按照最大程度防止新生儿漏诊又兼顾减少复查率的原则，本研究最终设定G-6-PD酶活切值为21 U/dl。