大鼠闭合性胸外伤所致肺挫伤模型构建

2022-01-21 08:38汪雷付静怡吴伟铭郭翔杨异
中华胸部外科电子杂志 2021年4期
关键词:砝码造模动物模型

汪雷 付静怡 吴伟铭 郭翔 杨异

肺挫伤是胸部闭合性外伤后常见疾病,属于肺损伤,部分较严重的肺挫伤易进展为肺部感染、肺不张及急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),可直接导致患者死亡或遗留永久性的肺功能残障[1-2],严重影响生活质量,增加社会负担。随着我国经济的发展,交通日益发达、基础建设日益增多,此类疾病发生率在相当长时间将保持增长趋势。目前,临床上针对胸外伤所致肺挫伤的治疗措施主要以对症处理为主,对重症患者的疗效有限,究其原因,是对于此类疾病的发病及进展机制尚不清楚。良好实用的动物模型可以较好地模拟类似伤情,为进一步开展相关研究提供良好的平台。截至目前,文献报道的相关模型均存在不同程度的不足,如大动物犬、羊及猪动物模型花费高、稳定性较差[3-5],小动物造模器材较为复杂、难以复制等,限制了模型的应用[6-7]。本研究旨在建立一种简便实用、可推广的大鼠闭合性胸外伤所致肺挫伤模型。

材料与方法

一、造模装置的制作及原理

一根垂直中空PVC管道(管径稍大于砝码最大直径,长度、管径可按实验要求选择),由连接装置固定于木质小动物解剖台(用于固定实验动物),撞击器材为不同质量的制式砝码(图1)。工作原理是通过砝码从一定高度自由落体,以一定能量撞击实验动物右胸,造成其肺挫伤。空气摩擦力忽略不计,打击能量的计算根据公式E=mgh(g=9.8 m/s2)。参照前期预实验结果,选择砝码质量为200 g,100 g,自由落体高度为60 cm和100 cm。

图1 造模装置(木质小动物解剖台通过连接装置固定PVC管道)

二、动物分组及实验方法

选取SD雄性大鼠40只,体重220~240 g,由上海市第六人民医院动物实验室提供。根据造模能量的不同,参考以往文献,结合预实验结果,按随机数字表法随机分为A组(对照组,撞击能量0 J)、B组(100 g,60 cm,撞击能量0.588 J)、C组(100 g,100 cm,撞击能量0.98 J)、D组(200 g,60 cm,撞击能量1.176 J)、E组(200 g,100 cm,撞击能量1.96 J),每组8只。具体实验过程:大鼠造模前12 h禁食禁水。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉满意后(3%戊巴比妥钠,1:5稀释,每100 g体重注射1 mL),大鼠仰卧位,右上肢外展,固定后,暴露右侧胸壁,局部剃毛,将不同质量制式砝码从不同高度自PVC管道垂直自由落体(管道作用是保持砝码垂直自由落体,管壁不与砝码接触),打击点为SD大鼠右侧第4肋间范围。

三、肺挫伤程度的评估

1.影像学评估:通过CT计算肺挫伤比值。存活大鼠在造模24 h后送至小动物CT平台(SkyScan 1176,Bruker MicroCT,Kontich,Belgium)行薄层CT扫描,层厚35 μm。扫描后利用体积计算程序,在横断面图像上,定位挫伤区域后,从上至下逐个层面描记挫伤肺组织的轮廓,系统体积计算程序自动生成该侧挫伤肺组织体积的绝对值。同样方法逐个层面描记、生成该侧总肺组织体积绝对值。计算得出肺挫伤比值=(肺挫伤体积之和/肺体积之和)×100%。

2.病理学评估:造模后24 h,完成CT检查后处死动物,选取肺挫伤部位,予组织固定液固定(10%中性缓冲甲醛固定液),切片后HE染色,镜下观察肺挫伤程度。

四、统计学分析

数据处理应用SPSS20.0软件。计量资料采用±s表示,多组间对比采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组实验动物大体情况及病死率

A组、B组、C组、D组无死亡,E组死亡3只,均在造模后出现呼吸动作异常,30 min内死亡,E组病死率37.5%,解剖发现均为右侧多根多处肋骨骨折、胸廓软化,胸腔可见大量血块。

二、影像学检查结果

胸部CT提示:A组、B组大鼠无明显骨折,C组、D组各有单根和两根骨折1例,A组、B组、C组及D组无明显血气胸。E组存活大鼠有3只发生2根肋骨骨折,1只发生3根肋骨骨折,另一只发生3根以上肋骨骨折(合并少量血胸)。各组肺挫伤比值见表1。统计学分析提示4组间肺挫伤体积占正常肺组织体积的百分比差异有统计学意义(P<0.05)。肺挫伤的不同CT表现见图2,其中以局部云絮样改变更为多见。

图2 肺挫伤CT表现:局部可见云絮样改变(A),局部肺实变(B)

表1 各组肺挫伤比值

三、病理检查结果

HE染色提示肺挫伤组织发生不同病理改变,A组大鼠肺部无挫伤。大鼠肺部挫伤表现为肺泡内淤血(图3A),或肺泡内淤血,局部炎性细胞浸润(图3B),也可表现为大量炎性细胞浸润,肺泡间隙异常增大(图3C),以前两种表现为主。大鼠心脏切片HE染色提示,心肌组织无明显损伤(图4)。

图3 肺挫伤镜下病理表现(HE,×100):少许肺泡内淤血(A),或较多肺泡内可见淤血,局部炎性细胞浸润(B),也可表现为大量炎性细胞浸润,肺泡间隙异常增大(C)

图4 心肌细胞无明显损伤(HE,×100)

讨 论

肺挫伤是闭合性胸外伤较常见的并发症,部分轻症患者可自愈,部分较重患者如不及时处理,可进展为肺部严重并发症甚至ARDS。肺挫伤是胸外伤预后不佳的主要危险因素之一[8],虽然本质上也属于急性肺损伤,但由外伤性肺挫伤、全身感染或其他原因所致的ARDS病死率并不相同[9],提示不同致病因素肺挫伤发生进展机制可能并不完全一致。截至目前,肺挫伤的具体发生机制的理论研究和有效治疗方法的临床实践均无突破,因此构建合适的动物模型尤为重要。

目前已有的肺挫伤模型中,大动物模型有犬、羊、猪,虽然这些模型部分模仿了人类受伤,但体型大,制作需要较高的人力及较多的经费,且缺乏分子探针、其他细胞和介质特异性试剂,限制了进一步使用;有学者构建了啮齿类动物模型,但造模的器材较为复杂,大多需要专门的设备,如特制保护罩、专用撞击装置等[10-11],重复此类实验必须有相应特制器材,这进一步增大了建模难度,增加了成本。本研究的造模装置用材常见,安装简单,利于推广,尤其适合基层单位开展研究。既往研究均已建立双侧肺挫伤模型和单侧肺挫伤模型,但本中心在临床工作中发现,近年来,随着致伤原因的改变,单侧肺挫伤较双侧肺挫伤更多见,因此更贴近临床。本研究构建了单侧损伤模型。此外,单侧损伤模型避开撞击左胸,更有利于避免心脏损伤,一定程度上减少了后续研究的干扰因素。

建模动物肺挫伤的程度是建模的关键指标之一。如肺挫伤过于严重,模型动物可能近期死亡,或干预效果不能体现,肺挫伤程度较轻,动物常快速自行修复,目前动物模型的肺挫伤具体程度尚无统一意见,本研究认为应将肺挫伤程度控制适中。目前认为CT是评估肺挫伤程度敏感度最高的检查[12]。有研究证实,肺挫伤体积占总肺体积28%以上是继发ARDS等严重肺部并发症的临界预测指标[13]。结合预实验发现肺挫伤占比超过40%以上的大鼠较易发生死亡,肺挫伤占比20%以下的大鼠大多很快恢复,设定20%~40%作为建模的肺挫伤具体标准。本研究建立的1.176 J能量模型组,全组大鼠无死亡,造模后24 h胸部CT检查提示肺挫伤体积(32.74±4.14)%,数据差异相对较小,可重复性强,达到了预期目标。

本组实验造模出现肋骨骨折相对较少,主要原因是制式砝码底部较宽,打击接触面积相对较大,局部压强不至于过分集中,一定程度上减少了肋骨骨折发生。此外,心肌病理检查显示心肌无明显损伤。提示撞击重物选择和撞击范围较为满意。本研究撞击的能量小于其他实验,主要原因有2点:本组实验构建的是单侧肺挫伤模型,能量直接用于造模,有些研究撞击的能量在特殊装置中部分消耗;二是本组实验动物由于小动物CT机扫描床规格所限,检查动物体质量原则上不能选择超过250 g,相较其他研究中动物质量较小。

本实验紧贴临床实际,装置制作简便,致伤原理单一,较好地模拟了闭合性胸外伤致伤环境,以打击高度和撞击物的质量作为变量,可以根据实际情况调节,实验结果可重复性较高,为闭合性胸外伤肺挫伤的机制及治疗研究提供了较好的动物模型,尤其适合基层单位开展相关研究。

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