蚯蚓摄食污泥对其肠道功能区微生物种群及耐药基因的影响

彭兰生,关孟欣,黄 魁,夏 慧,桑春雷

蚯蚓摄食污泥对其肠道功能区微生物种群及耐药基因的影响

彭兰生,关孟欣,黄 魁*,夏 慧,桑春雷

(兰州交通大学环境与市政工程学院,甘肃 兰州 730070)

以赤子爱胜蚓()为实验蚓种,研究蚯蚓消化污泥前后,其肠道各功能区微生物种群结构及耐药基因(ARGs)丰度的变化情况.为表征活体功能性微生物,所取新鲜样品均采用叠氮溴化丙锭(PMA)预处理后,再进行DNA相关分析.结果表明:蚯蚓消化污泥5d后,细菌16S rDNA和真核生物18S rDNA的丰度在其胃中分别显著增加了28.2倍和42.2倍(<0.05),而在砂囊和后肠中均显著性降低(<0.05).此外,蚯蚓消化污泥使其砂囊中的优势菌门由变形菌门变为软壁菌门,胃中的优势菌门由拟杆菌门变为厚壁菌门,而对后肠微生物种群结构的影响较小.对于ARGs而言,大环内酯类耐药基因F、四环素类耐药基因X和磺胺类耐药基因2在蚯蚓胃中的丰度分别显著升高了1.9×102倍、8.4×105倍和25.9倍(<0.05),而在其砂囊和后肠中ARGs总丰度分别显著下降了11.0倍和45.2倍(<0.05).基于网络分析结果显示,蚯蚓摄食污泥可影响其肠道内ARGs宿主细菌的结构多样性.

污泥资源化；蚯蚓堆肥；抗性基因；肠道微生物；生物污染物

随着我国污水处理能力的快速提升,污泥产量亦逐年增加.截止2019年底,我国污泥年产量达3904万t(以含水率80%计)[1],污水污泥的处理处置已成为水处理行业亟需解决的难题[2].脱水污泥作为污水处理的终端副产物,积蓄了丰富的新兴污染物如雌激素、微塑料、耐药基因(ARGs)及病毒等[3].研究证实污泥是ARGs最丰富的储库之一[4].由于污泥具有较高的微生物群落多样性,致使促进ARGs可通过质粒、整合子、转座子等可移动遗传元件在不同微生物之间发生水平转移[5-6].ARGs一旦转移到人类致病菌中形成超级细菌,将给人类疾病的治疗带来很大的困难.现有的研究表明传统污泥资源化方法难以有效去除污泥中的ARGs[7-8],给污水污泥的处理处置带来了新的挑战.

蚯蚓堆肥是利用蚯蚓和微生物共同作用的环境友好型污泥资源化技术[9].蚯蚓肠道消化行为被认为是影响污泥蚯蚓堆肥效率的关键因素[10].蚯蚓砂囊、胃及后肠共同组成了其完整的消化系统链.砂囊是蚯蚓肠道消化系统的前端,它主要通过机械研磨作用破碎食物和微生物[11],蚯蚓胃部能够分泌淀粉酶和蛋白酶,促使食物进一步被消化.蚯蚓后肠可以分泌多种酶类消化有机物,并吸收转化为自身的营养物质,已被认为是蚯蚓消化系统中最关键的部位.先前的研究表明,蚯蚓堆肥可显著去除污泥中四环素和氟喹诺酮类ARGs[12-13],且去除效果与蚯蚓肠道消化过程及其定植微生物结构多样性密切相关.因此,针对蚯蚓肠道各功能区消化过程对污泥ARGs的影响研究能揭示蚯蚓肠道削减ARGs的关键机制.

本研究以污泥在蚯蚓肠道消化过程为研究对象,比较蚯蚓肠道消化污泥前后其各功能区微生物的种群演化及ARGs丰度的变化特征,旨在为污泥蚯蚓堆肥削减ARGs提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用健康有明显环带的赤子爱胜蚓()为供试蚓种,单体重约0.5g,为本实验室饲养.采用底部开孔的长方体塑料箱(46cm×17cm×13cm)作为堆肥反应器.本实验所使用的脱水污泥取自兰州市安宁污水处理厂脱水车间的新鲜污泥.污泥的理化性质见表1.

表1 实验所用污泥理化性质

1.2 实验方法

为防止堆肥体系缺氧,先将脱水污泥制成粒径为5mm的污泥颗粒,之后将已过夜清肠的400条健康的赤子爱胜蚓接种至3kg新鲜污泥颗粒中.蚯蚓堆肥实验在生化培养箱恒温20℃下进行,实验设置3组重复.所有反应器用带孔的保鲜膜覆盖,每隔3d喷洒少量水分保持湿度在60%～70%左右.蚯蚓消化5d后,分别从每个反应器中随机挑选3～5条健康的赤子爱胜蚓,将其迅速放进装有无水乙醇的培养皿中杀死.然后在无菌超纯水中清洗3次,去除蚯蚓表层微生物的影响.致死后的蚯蚓按照环节数分区后,立即在无菌操作台上用镊子和刀片进行解剖并获取蚯蚓砂囊、胃及后肠组织样品.每3～5条蚯蚓组织作为一个样品.

1.3 测试方法

1.3.1 理化指标 理化测试方法参考黄魁等[14]方法进行.简述如下:含水率及有机质含量均采用恒重法.将研磨后的风干样与去离子水(干样:水=1:50kg/L)混匀后测定pH值(雷磁PHS-3C,上海)和电导率(雷磁DDS-307,上海).氨氮采用纳氏试剂分光光度计法(HJ 535-2009)[15].溶解性有机碳(DOC)为上述混合液稀释10倍后,过0.45μm滤膜,用碳氮分析仪(耶拿MULTI N/C,2100,德国)进行测定.

1.3.2 叠氮溴化丙锭(PMA)处理及DNA提取 将蚯蚓砂囊、胃与后肠组织样品分别放入无菌研钵,加入2mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)研磨成液体状.随后将组织样品收集到无菌离心管中,加入5μL的25μmol/L PMA,于4℃静置10min.然后置于LED灯(EM200,Takara)下照射20min,每隔5min将离心管取出摇晃一次,以确保PMA能充分与死菌DNA结合.采用DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN,德国)试剂盒分别提取蚯蚓砂囊、胃及后肠组织总DNA.并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测浓度,最后将DNA样品于-20℃冰箱保存备用.

1.3.3 荧光定量PCR 荧光定量PCR反应在Thermal Cycler Dice Real Time System Lite TP700 (Takara,大连)仪器上进行.定量反应为25μL体系: 12.5μL TB GreenⅡ(Takara,大连),20μmol/L上下游引物各0.5μL,1μL DNA模板以及10.5μL DNA-free超纯水.采用携带目的基因的大肠杆菌(,)质粒,经连续10倍稀释作为定量PCR的标准品.用DNA-free超纯水作为阴性对照,每个样品做3次重复.所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列及反应条件见表2.

1.3.4 质粒的制备 目的基因进行PCR扩增后,切胶回收与纯化,利用T-A克隆将其连接至 pMD20- T载体(Takara,大连).而后转化至DH5α感受态细胞内,Luria-Bertani固体培养基中培养16h后,筛选白色阳性克隆子进行培养富集.使用质粒提取试剂盒(Takara,大连)提取质粒DNA.利用Nanodrop (Thermo,美国)检测质粒DNA浓度.

表2 耐药基因引物及其PCR反应条件

1.3.5 PCR和高通量测序 采用细菌通用引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R (5'- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')对细菌16S rDNA的V3-V4区进行扩增.使用Phusion High- Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer(M0531NEB)高保真酶进行扩增.PCR反应体系为30μL.PCR扩增条件为:95℃预变性1min;30个循环包括98℃变性10s,50℃退火30s,72℃延伸30s;72℃终延伸5min.使用2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测后,利用GeneJET胶回收试剂盒(Thermo Scientific)对产物进行纯化.使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit对文库进行定量,接头效率检测,合格后使用NovaSeq6000平台进行测序(诺禾致源生物信息科技有限公司,北京).测序完成后,使用FLASH (v1.2.7)对序列进行拼接,测序结果使用QIIME(1.9.1)软件对序列进行质控过滤后,将获得高质量的tags序列使用VSEARCH二进制文件(https://github. com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比较,去除嵌合序列.随后使用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)将相似度97%OTUs (Operational Taxonomic Units)进行聚类.而后对OTUs序列进行物种注释,通过MUSCLE 3.8.31与Silva132数据库(http://www.arb-silva.de/)进行对比,获得各OTU的分类学信息.测序结果已上传至NCBI数据库,上传序列号为:SAMN19321836～SAMN19321856.

1.4 统计分析

使用SPSS 26统计软件对各测试指标在各组之间的差异进行单因素方差分析,显著性水平为0.05.使用Heml 1.0进行热图绘制并进行聚类.图1、2、4均用OriginPro 2018(version 9.5)绘制.微生物与耐药基因之间的关系网络图用Gephi(0.9.2)绘制.

2 结果与讨论

2.1 蚯蚓肠道功能区活体微生物数量及种群结构变化

2.1.1 活体微生物数量的变化 如图 1 所示,蚯蚓摄食污泥后其砂囊和后肠中活体细菌丰度分别显著性降低了1.1×102倍和2.9倍(<0.05),而胃中活体细菌丰度则显著性增加了28.2倍(<0.05).对于真核生物而言,其丰度在蚯蚓砂囊和后肠中分别显著性降低了1.6×103倍和1.3×102倍,但在胃中显著性增加了42.2倍.由此可见,受摄食污泥的影响,蚯蚓肠道各功能区中细菌与真核生物的数量均表现出相近的变化趋势.蚯蚓砂囊中活体微生物数量显著降低,可能是因为微生物数量在砂囊区域存在瓶颈效应[16-18].Hu等[11]研究发现蚯蚓摄食牛粪或污泥,在其砂囊和后肠区域细菌丰度均显著性降低,但砂囊区域降低幅度大于后肠.这与本研究的结果相近.另外,蚯蚓胃中活体微生物数量显著增加归因于蚯蚓胃作为内源性微生物和外源性微生物交互的场所,致使大量的微生物群落在蚯蚓胃中集聚.

RS代表原始污泥,IG和FG分别代表原始蚯蚓砂囊和消化后蚯蚓砂囊,IS和FS分别代表原始蚯蚓胃和消化后蚯蚓胃,IH和FH分别代表原始蚯蚓后肠和消化后蚯蚓后肠;同种功能区(如IG和FG)之间不同字母表示其之间具有显著性差异(<0.05),相同字母表示没有显著性差异(>0.05),不同功能区之间没有比较意义,下同

表3 蚯蚓摄食污泥前后蚯蚓功能区细菌种群的Shannon指数与Simpson指数

注:同种功能区(如IG和FG)之间相同字母表示没有显著性差异(>0.05),不同功能区之间没有比较意义.

图2 蚯蚓摄食污泥前后肠道功能区细菌门水平种群结构

图3 蚯蚓摄食污泥前后蚯蚓肠道功能区细菌优势菌属的丰度热图

2.1.2 活体微生物种群结构的变化 由表3可见,蚯蚓摄食污泥后其砂囊和后肠中细菌种群的Shannon指数和Simpson指数均有所降低,但不具有显著性(>0.05).该结果说明蚯蚓消化污泥会降低其砂囊和后肠中活体细菌种群的丰富度和均匀度.相似研究发现,蚯蚓吞食牛粪或污泥,其砂囊区域细菌种群多样性和均匀度均显著下降[11].本研究中蚯蚓后肠中降低的活体细菌多样性和丰富度,可能是由于蚯蚓后肠近乎厌氧的微环境[19]致使摄入的好氧微生物出现死亡所致.同时,蚯蚓胃中细菌种群的Shannon指数和Simpson指数分别增加了16.7%和3.2%,这种增加的趋势与微生物数量的变化类似.

图4 蚯蚓摄食污泥前后肠道功能区ARGs的绝对丰度

由图2可得,蚯蚓摄食污泥前,其砂囊中定殖的活体细菌菌门主要有变形菌门(64.2%)、厚壁菌门(13.8%)、拟杆菌门(10.5%)和放线菌门(5.2%);而摄食后砂囊中软壁菌门占绝对优势,其丰度由1.5%激增至55.7%.已有研究表明软壁菌具有较强的核酸降解能力[20],其丰度的剧增表明蚯蚓砂囊可能是降解污泥中耐药基因的主要场所.而砂囊中变形菌门的丰度显著(<0.05)降低了60.4%.变形菌门丰度经蚯蚓砂囊显著下降一方面可能是由于蚯蚓常以γ-变形菌门和δ-变形菌门下属微生物为食[11,21],另一方面可能是被砂囊中分泌的一些抗菌物质所抑制[22].此外,陈景阳等[23]研究发现四环素会抑制变形菌门的丰度,且这种抑制与其剂量无关,这也可能是造成变形菌门丰度下降的原因.由图2可见,蚯蚓摄食污泥前,蚯蚓胃中拟杆菌门(42.3%)、厚壁菌门(19.8%)、放线菌门(16.9%)与变形菌门(14.5%)为细菌优势菌门,而摄食后胃中优势菌门转变为厚壁菌门(31.9%)、变形菌门(25.4%)、拟杆菌门(17.0%)、放线菌门(11.3%)与绿弯菌门(3.0%).相比而言,摄食污泥致使蚯蚓胃中变形菌门与厚壁菌门的相对丰度分别显著(<0.05)增加75.2%和61.1%,可能与其摄食污泥的微生物种群结构有关.同时,蚯蚓摄食污泥后,后肠中软壁菌门和拟杆菌门的相对丰度分别显著(<0.05)增加了402.3%和170.4%.这是由于拟杆菌门是大分子有机物的主要降解者并且软壁菌门对氮、磷等元素的循环有重要的驱动作用[20,24],其二者丰度的激增表明蚯蚓后肠是污泥中大分子有机物的降解场所.Wang等[22]也研究发现有机物的分解消化主要发生在蚯蚓后肠.本研究发现,与原始污泥相比,蚯蚓消化污泥后的蚓粪中有机质含量下降了13.4%,电导率升高了2.0%,表明蚯蚓肠道是加速有机物的矿化和降解的重要场所.

由图3可知,蚯蚓摄食前,砂囊中优势菌属为、、、、、和,其中的丰度占绝对主导地位.而蚯蚓消化污泥后,砂囊中占主导地位,且显著增加了37.1倍(<0.05).同时,蚯蚓摄食污泥后胃中与的丰度分别增加了28.9倍和10.8倍(<0.05).属于虫原体属,可利用碳水化合物磷酸转移酶发酵葡萄糖,同时具有水解精氨酸的能力[25],其在砂囊和胃中丰度的剧增,表明其参与了大量的能量和物质的代谢.是属于β-变形菌门的一种蚯蚓体内的共生菌.研究显示其丰度的增加能够促进蚯蚓更早的性成熟,而且孵化成茧的成功率更高[26].相比而言,蚯蚓摄食前后,其后肠中细菌属水平结构的变化较小,未呈现出显著性差异(>0.05).有研究发现食物来源会影响蚯蚓肠道微生物种群结构,但是与蚯蚓肠道相关的核心微生物种群基本保持不变[27].Hu等[11]分别以污泥和牛粪为食物饲养蚯蚓,发现相比于污泥,蚯蚓摄食牛粪后其肠道微生物种群结构变化较小,这与本研究相似.王洪涛等[28]研究了含砷土壤对4种蚯蚓肠道微生物种群的影响,发现变形菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、放线菌门和酸杆菌门是土壤中的优势菌群,占比高达73.4%.而4种蚯蚓肠道内的优势菌基本一致,主要是放线菌、厚壁菌和变形菌等,它们的相对丰度总和为76.6%.这说明底物与蚯蚓肠道微生物种群间既相互影响,又相互共存.由聚类分析(图3)可见,IG组和FG组、IS组和FS组之间种群结构存在较大差异,而IH组和FH组种群结构差异较小,表明蚯蚓摄食污泥对后肠中微生物种群结构影响较小.这可能是因为蚯蚓后肠特殊的生境构建了能够满足其生理需求的功能性微生物库,该库能够较好地抵抗外源微生物菌群与环境条件变化的胁迫,其形成的过程与肠道内微生物不断适应新环境与重金属、抗生素等污染物有一定的关联[29-30].

2.2 蚯蚓肠道功能区ARGs丰度变化

紫色节点代表可移动遗传元件,蓝色节点代表ARGs,黄色节点代表微生物;节点之间的连线表示节点之间显著性的相互关系,红色连线代表正相关,绿色连线代表负相关;连线的粗细与节点间的显著性成正比

如图4a所示,蚯蚓摄食污泥后,I1(整合子基因)丰度在其砂囊中略有增加(>0.05),而其在胃中显著增加了4.4倍(<0.05),但其在后肠中显著降低了3.0倍(<0.05).I1作为一种携带ARGs的遗传元件,生物介质中较高的细菌数量和多样性会增加I1水平传播的可能性[6,31].李建辉等[32]通过宏基因组学研究了牛粪蚯蚓粪、蔬菜蚯蚓粪和污泥蚯蚓粪中的微生物组成结构,发现含有较高微生物丰度和多样性的污泥蚯蚓粪中整合子所占比例也较高.本研究中蚯蚓胃和后肠中I1的增减与胃和后肠中微生物数量及多样性的变化有密切关联.

对于ARGs而言(图4b～f),蚯蚓摄食污泥后,砂囊中除F(大环内酯类ARGs)丰度显著升高了10.7倍(<0.05)外,X、M(四环素类耐药基因ARGs)、1和2(磺胺类ARGs)均有所降低.其中X显著下降了18.9倍(<0.05),2显著下降了87.4倍(<0.05),耐药基因总丰度显著下降11.0倍(<0.05).蚯蚓胃中除1外,F、X、M和2丰度在摄食污泥后均有不同程度升高,其中F、X、和2分别显著升高了1.9×102倍、8.4×105倍和25.9倍(<0.05).对于蚯蚓后肠,除F外,X、M、1和2在摄食污泥后均有不同程度的降低,其中X、1和2分别显著降低了3.4×102倍、8.4×105倍和45.0倍(<0.05),耐药基因总丰度显著下降45.2倍(<0.05).以上结果说明蚯蚓胃会对污泥中的ARGs具有选择性富集作用,而蚯蚓砂囊和后肠对ARGs具有一定的抑制作用.这主要是因为在胃中发生了微生物种群的聚集效应,使得聚集的细菌群落成为了ARGs的受体[33-34],而蚯蚓后肠中的黏液具有选择性杀菌作用,可导致某些ARGs的宿主细菌死亡,如粪产碱菌()、假单胞菌属()及抗坏血酸克吕沃尔氏菌()等变形菌门中的细菌[35-36].而变形菌门可同时携带四环素类和磺胺类ARGs[37],从而致使后肠中四环素类和磺胺类ARGs丰度降低.值得注意的是,蚯蚓摄食污泥后,肠道总ARGs丰度较摄食前仍显著增加了3.3倍(<0.05),这可能是污泥中较高含量的ARGs所致.污泥中抗生素的胁迫也会影响肠道ARGs的产生与传播[38].例如,长期暴露于抗生素下导致蜜蜂肠道中四环素类ARGs中的8种亚型发生了富集[39]. Ding等[40]对长期施用污泥及鸡粪肥土壤蚯蚓肠道中的ARGs进行研究发现,污泥和鸡粪的施用显著增加了蚯蚓肠道中ARGs的丰度和多样性,在9种主要的ARGs中共检测到98个亚型.虽然F与1的丰度在蚯蚓肠道中表现出下降趋势,但蚯蚓作为污泥蚯蚓堆肥的关键主导者,其蚯蚓肠道总ARGs丰度的增加说明蚯蚓肠道是可移动的ARGs储蓄库,这亦是污泥蚯蚓堆肥难以完全削减污泥中的ARGs的重要原因之一.

2.3 ARGs与活体微生物的网络分析

依据ARGs与活体微生物的共线性,利用网络分析可揭示ARGs的潜在宿主细菌[41-42].如图5所示,ARGs与活细菌之间构建的网络共包括16个节点和60条边.蚯蚓摄食污泥前(图5a),蚯蚓肠道内有6种细菌菌属与I1呈正相关,说明其为I1潜在的宿主细菌.相比而言,F潜在的宿主细菌有3种,X和M潜在的宿主细菌均有7种,而1和2潜在的宿主细菌都为5种.蚯蚓摄食污泥后(图5b),I1潜在的宿主细菌变为4种,F潜在的宿主细菌变为5种,X和M潜在的宿主细菌分别为6种和7种,而1和2潜在的宿主细菌分别为5种和4种.这些结果表明蚯蚓摄食污泥可影响其肠道内ARGs宿主细菌菌群的结构多样性.不仅如此,蚯蚓堆肥还可显著影响超级细菌的种群结构多样性[43].有研究表明,环境中的重金属铜与大环内酯类ARGs之间能够形成共选择作用,从而激活大环内酯类ARGs的表达[44].因此可推测本研究中及等细菌从摄食前的非F宿主变为摄食后F宿主,可能与污泥中的重金属等污染物激活了F的表达有关.

3 结论

3.1 蚯蚓摄食污泥会增加其胃中活体微生物的数量、多样性和均匀度,而对其砂囊和后肠则表现出相反的结果.

3.2 蚯蚓摄食污泥后,蚯蚓肠道总ARGs丰度略有增加.蚯蚓砂囊和后肠具有削减耐药基因的作用,而蚯蚓胃对ARGs具有一定的富集作用.

3.3 蚯蚓摄食污泥可影响其肠道内ARGs宿主细菌的结构多样性.

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Effects of excess sludge fed by earthworms on microbial community and antibiotic resistance genes in their intestinal functional area.

PENG Lan-sheng, GUAN Meng-xin, HUANG Kui*, XIA Hui, SANG Chun-lei

(School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China)., 2022,42(1)：465～473

This study aimed to investigate the changes of microbial community structure and their antibiotics resistance genes (ARGs) abundances in the intestinal tract of, via detecting the sludge passing through different functional areas in earthworms’ gut. Prior to the DNA extraction, all fresh samples were pretreated with propidium monoazide (PMA) to characterize active functional microorganisms. The results showed that the abundances of bacterial 16S rDNA and eukaryotic 18S rDNA significantly increased (<0.05) by 28.2 and 42.2 times in stomach, and they significantly decreased (<0.05) in the gizzard and hindgut, after 5 days of earthworm digestion. In addition, the sludge digested by earthworms changed dominant proteobacteria to tenericutes in gizzard, and modified dominant bacteroidetes to firmicutes in stomach. However, the digestion process of earthworms had little effect on bacterial community structure in hindgut. For the ARGs, the abundances ofF,X and2 significantly increased (< 0.05) by 1.9×102, 8.4×105and 25.9 times in stomach of earthworm, respectively. While the total abundances of ARGs in gizzard and hindgut significantly decreased (<0.05) by 11.0 and 45.2 times, respectively. Moreover, network analysis revealed that the feeding behavior of earthworms for sludge could indicate effects on the structural diversity of host bacteria of ARGs in their intestine.

sludge recycling；vermicomposting；resistance genes；gut microbiota；biological pollutants

X172

A

1000-6923(2022)01-0465-09

彭兰生(1995-),男,甘肃兰州人,兰州交通大学硕士研究生, 主要研究方向为污泥资源化.发表论文1篇.

2021-5-25

国家自然科学基金资助项目(51868036;52000095);兰州交通大学百人计划(第二批);甘肃省青年博士基金项目(2021-QB051);甘肃省优秀研究生“创新之星”项目(2021CXZX-629)

* 责任作者, 副教授, huangk1199@hotmail.com