沉默BECN1对人三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响*

钟 俊，樊海波，张浩然，黄凤婷，黄锦明，云雪燕，刘志明

（广西医科大学第二附属医院，南宁 530007）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据报道，2020年女性乳腺癌成为全球恶性肿瘤发病的首位，已经超越肺癌成为最常见的恶性肿瘤[1]，其中三阴性乳腺癌（triple-negtive breast cancer，TNBC）具有较高的侵袭性，是乳腺癌中预后最差的亚型[2]。目前，针对雌激素受体（estrogen receptor，ER）或人类表皮生长因子受体2（human epithelial growth factor receptor 2，HER2）阳性的乳腺癌应用内分泌治疗和分子靶向治疗均可取得良好的效果。但是，对于TNBC 的临床治疗效果不佳。因此，为TNBC寻找更有效的、新的治疗方法成为研究的热点。

自噬是一个细胞通过吞噬自身细胞成分并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，降解所囊括内容物的过程，借此循环细胞成分来完成细胞的代谢需求和维持能量稳态[3]。发生在正常组织和细胞中的自噬，是细胞对代谢和缺氧应激的适应性反应，对正常细胞的存活具有保护性作用[4]，自噬也参与肿瘤发生、发展和肿瘤的耐药过程，但其作用机制仍未明了。自噬是多分子参与的复杂过程，研究表明，beclin 1（BECN1）作为特异性的自噬基因，属于自噬相关基因（autophagy-related genes，ATGs），是调控自噬的重要分子[5]。BECN1通过作用于吞噬泡的形成与成熟，影响自噬体的表达，从而调节细胞内的自噬水平[6]。有研究报道，通过沉默结肠癌细胞中BECN1 基因发现抑制自噬后能明显抑制细胞增殖并且促进凋亡[7]，而抑制自噬活性与TNBC 细胞增殖与凋亡的相关研究鲜有报道。本研究探讨通过在TNBC MDA-MB-231细胞中沉默BECN1基因的表达观察其对细胞生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂 人TNBC MDA-MB-231细胞购自上海中乔新舟公司；

DMEM培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司）；胰酶、RIPA 裂解液（美国Sigma 公司）；沉默BECN1慢病毒的组1、组2、组3 及阴性对照慢病毒均由上海吉凯生物公司合成；总RNA 提取试剂盒、反转录cDNA合成试剂盒、PCR引物、实时荧光定量PCR试剂盒（日本Takara 公司）；兔抗人BECN-1 单克隆抗体、兔抗人LC3B单克隆抗体、兔抗人Gapdh单克隆抗体、兔二抗（美国Proteintech公司）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（美国MCE公司）；Transwell小室、基质胶（美国corning 公司）；AnnexinV-APC/7-AAD 染色试剂盒、细胞周期试剂盒（杭州联科公司）。

1.2 细胞培养 MDA-MB-231 细胞使用含10%胎牛血清、100 U/mL青—链霉素的DMEM培养基（完全培养基），培养于37 ℃含5%CO2的培养箱。

1.3 细胞分组与慢病毒感染 将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞接种到6孔板，当融合度达到60%时，以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10，将含有阴性对照（negative control，NC）慢病毒感染组、3种沉默BECN1慢病毒分别感染干扰组1、干扰组2以及干扰组3，空白组不做处理。在72 h后于荧光显微镜下检测细胞荧光情况，然后给予含嘌呤霉素的完全培养基持续筛选两周。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实验检测各组信使核糖核酸的表达 收集生长状态良好的各组细胞，提取各组细胞的总RNA，逆转录成互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），在RT-qPCR 仪StepOnePlus 上进行PCR 扩增，反应条件：预变性，95 ℃，30 s（1 个循环）；变性，95 ℃，5 s；60 ℃退火，延伸30 s，共40 个循环。BECN1 引物序列，上游：5’-CCAGATGCGTTATGC-CCAGAC-3’，下游：5’-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3’。应用2-ΔΔCT法计算BECN1 mRNA的相对表达量。

1.5 蛋白免疫印迹(Western blotting，WB)实验检测蛋白的表达 收集各组细胞的总蛋白，BCA法检测总蛋白的浓度。加入适量上样缓冲液，于金属浴机中煮沸10 min 使蛋白变性，SDS-PAGE 凝胶电泳（60 V/150 min），湿转法转至PVDF 膜（110 mA，120 min），封闭液室温封闭15 min，一抗4 ℃冰箱孵育过夜，TBST 洗膜3 次，5 min/次；二抗室温摇床孵育2 h，使用ECL 液孵育30 s，扫膜及分析条带灰度值，使用Image J 分别计算BECN1 与自噬特异性蛋白LC3B的相对表达量。

1.6 细胞增殖实验 取对数生长期的各组细胞制备成单细胞悬液，使用完全培养基将细胞数量调整至5×104个/mL，取每孔100 μL 接种于96 孔板进行培养，每组设置6 个复孔，分别培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃反应1 h，使用酶标仪在450 nm 波长处检测各孔的吸光度值（OD值）。

1.7 细胞侵袭与迁移实验 在细胞侵袭实验中，将被稀释后的基质胶（基础培养基：基质胶=9∶1）加入Transwell 小室的上室并放入培养箱孵育2 h，使用基础培养基将生长状态良好的各组细胞制备成5×105个/mL 的细胞悬液，取100 μL 将细胞接种于Transwell小室的上室，将600 μL完全培养基加入小室的下室，放入培养箱孵育24 h 后，加入细胞固定液，0.1%结晶紫染色液后随机选取5 个视野于显微镜下拍照并计数；在细胞迁移实验中，除了不需要在Transwell小室的上室加入基质胶，其余步骤等同于侵袭实验。

1.8 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 将细胞培养48 h后，用PBS清洗两次，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集细胞后离心5 min，弃上清，用1 mL 1×的Binding Buffer 重悬细胞后将细胞加入1.5 mL的EP 管，接着分别加入10 μL 的APC 和5 μL 的7-AAD 进行染色，室温避光孵育10 min 后上机检测，计算细胞凋亡率。

1.9 流式细胞术检测各组细胞周期 将细胞培养48 h后，用PBS清洗，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集细胞后离心5 min，弃上清，用1 mL的DNA Staining solution 重悬细胞后加入1.5 mL 的EP 管，接着加入10 μL 的Permeabilization solution，室温避光孵育30 min后上机检测，计算各期细胞的比例。1.10 统计学方法 所有数据均应用SPSS 26.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准（）差表示，多组间的比较使用单因素方差分析，组间两两的比较使用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞BECN1 mRNA的表达情况 RT-qPCR结果显示：与空白组、NC组相比，干扰组BECN1 mRNA的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），空白组与NC 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。其中干扰组2的相对表达量最低，用于后续的实验，见图1。

图1 各组细胞BECN1 mRNA相对表达量比较

2.2 各组细胞BECN1 蛋白与LC3B 蛋白的相对表达量比较 WB检测结果显示：干扰组BECN1蛋白的相对表达量以及LC3B蛋白中LC3-Ⅱ/LC31-Ⅰ的比值低于空白组和NC 组，差异有统计学意义（均P＜0.05），其中干扰组2 两种蛋白的相对表达量均最低，干扰组2用于后续的实验，见图2。

图2 各组细胞BECN1与LC3B蛋白相对表达量比较

2.3 3组细胞形态比较 通过显微镜观察细胞的生长，使用完全培养基培养一段时间后，相较于空白组与NC 组，干扰组2 的细胞生长缓慢，细胞间隙增大，且细胞形态呈细长状，见图3。

图3 3组细胞形态的比较（×200）

2.4 3组细胞增殖实验比较 CCK-8法检测细胞增殖能力的实验结果显示：干扰组2 的细胞活力相较于空白组与NC 组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），表示干扰组2的增殖能力下降，见图4。2.5 3组细胞迁移实验比较 Transwell迁移实验结果显示：干扰组2（204±18.38）穿过基底膜细胞数比空白组（377.5±31.81）和NC组（331.5±13.43）明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图4 3组细胞增殖能力比较

图5 3组细胞迁移能力比较（×200）

2.6 3 组细胞侵袭实验比较 侵袭实验结果显示：与空白组（111±7.07）和NC 组（112.5±2.12）比较，干扰组2（54.5±6.36）穿过基底膜的细胞数降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。

图6 3组细胞侵袭能力比较（×200）

2.7 3组细胞凋亡与细胞周期分布检测 流式细胞术凋亡实验结果显示：干扰组2 的细胞凋亡率（0.85±0.03）%与空白组（0.87±0.13）%、NC组（1.21±0.08）%比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。细胞周期实验结果显示，与空白组（55.3±4.84）%、NC 组（54.32±1.69）%比较，干扰组2（62.6±1.79）%的细胞处于G0/G1期的比例更高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图8。

图7 3组细胞的凋亡率比较

图8 3组细胞的细胞周期分布比较

3 讨论

自噬是细胞中普遍存在的生理机制，也在肿瘤发生、发展和肿瘤的耐药过程中起着重要的作用。LC3B 是判断自噬活性的特异性自噬标志蛋白。LC3B 蛋白有两种形式，在自噬形成时，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ紧密连接在自噬囊泡膜表面[8]。因此，通过WB 检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可反映细胞自噬水平的高低。当两者的比值减少时，表示自噬水平降低。

BECN1 是调控细胞自噬水平的关键基因[9]，与自噬囊泡的形成相关。有研究报道BECN1 在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤中表达缺失，甚至在多种TNBC细胞株中同样存在BECN1基因的缺失，但不包括MDA-MB-231 细胞[10]。BECN1 是一种抑癌基因[11]，在胃癌细胞中过表达BECN1促进自噬能明显抑制增殖、迁移与侵袭能力[12]；本课题组前期研究也表明：隐丹参酮通过过表达MDA-MB-231 细胞BECN1，促进自噬从而抑制增殖、侵袭与迁移能力[13]。然而，BECN1 在食管癌、结肠癌等肿瘤中呈现相反作用。刘飞等[14]研究表明：沉默食管癌细胞BECN1 基因，可抑制自噬，进而减弱癌细胞侵袭与迁移能力；汤俊照[15]则发现，过表达喉癌细胞BECN1 可促进细胞的增殖。由此可知，BECN1 在不同肿瘤细胞具有截然不同的作用。目前，通过沉默BECN1 抑制自噬与TNBC 细胞增殖及凋亡关系的研究鲜有报道。本研究发现沉默MDA-MB-231细胞BECN1 表达，细胞的增殖、迁移与侵袭能力均被明显抑制。此外，流式细胞实验发现各组细胞凋亡率没有明显差异，干扰组细胞增殖速度较对照组慢。我们推断沉默BECN1 表达可降低细胞的自噬水平，继而阻止MDA-MB-231细胞从G0/G1期进入S期，导致细胞周期停滞，从而抑制细胞增殖，其具体分子机制与调控通路有待进一步研究。本课题组前期研究还表明：沉默MDA-MB-231 细胞BECN1表达可提高多西他赛对细胞的敏感性，降低其增殖能力[16]，但能否同时提高其他化疗药物对MDAMB-231细胞的敏感性仍需后续深入研究。

综上所述，本研究发现沉默BECN1表达可明显降低MDA-MB-231 细胞自噬水平，抑制细胞增殖，使细胞周期停滞于G0/G1期，同时减弱细胞迁移及侵袭能力。这一成果为靶向TNBC BECN1 基因治疗提供了初步的实验依据，也为治疗TNBC 提供了新的治疗思路。