银杏内酯B对抑郁样行为大鼠炎症反应及氧化应激的调控作用*

苑晓伟，王 燕，许 彬

（1.乌鲁木齐市安宁医院精神科，乌鲁木齐 830023；2.中国南方航空股份有限公司新疆分公司航卫中心健康管理室，乌鲁木齐 830000；3.新疆医科大学第一附属医院心理医学科，乌鲁木齐 830054）

抑郁症是临床常见的心理疾病，以显著且持久的心情低落为主要临床特征，患者通常表现出绝望、悲观、自卑、抑郁等症状。流行病学研究表明，全球抑郁症发病率为4.4%，而中国人群的抑郁症发病率也高达4.2%，并呈现出逐年升高趋势[1]。作为一种长期心理性疾病，抑郁症给患者及家庭带来了巨大的精神负担，如不及时治疗，患者可能会产生悲观厌世，严重者可能会产生自杀倾向和行为，因此，对于抑郁症的及时干预和治疗十分重要[2]。目前普遍认为，包括海马组织在内的多种组织损伤与抑郁症的发生及发展密切相关[3]。近年来研究发现，患者长期处于抑郁状态会发生炎症反应及氧化应激损伤等全身反应或局部病理性改变，进而导致抑郁症加重[4]。目前临床上对于抑郁症的治疗主要采用心理干预及药物治疗的手段。银杏内酯B是从银杏叶提取得到的单体化合物，具有显著的神经保护作用，且对于海马组织的炎症反应及氧化应激损伤有较好的修复作用[5]。本研究旨在探讨银杏内酯B 对抑郁样大鼠的作用及其机制，为抑郁症治疗药物的研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物和主要试剂 银杏内酯B（上海研生实业有限公司，货号15291-77-7），使用蒸馏水配制成浓度为6 mg/kg 的溶液。氟西汀（常州四药制药有限公司，批号201910101），使用蒸馏水配制成1 mg/kg的溶液。白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购自碧云天生物科技有限公司；大鼠过氧化氢酶（CAT）ELISA试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒购自上海古朵生物科技有限公司。NF-κBP65、TNF-α、IL-1β、GAPDH兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验动物 72 只SD 大鼠，雄性，SPF 级，6～8周龄，体重180～220 g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002，饲养于SPF 级实验动物房，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h明暗循环。

1.3 实验分组及抑郁样行为大鼠模型的建立 动物适应性喂养一周后，随机分为正常对照组、模型组、氟西汀组及银杏内酯B 低、中、高剂量组，每组12只。正常对照组不作处理，其他各组采用慢性应激刺激法建立抑郁样行为大鼠模型[6]，具体步骤：将每只大鼠置于笼中单独饲养，并随机给予以下应激刺激，包括4 ℃冷水强迫游泳5 min、鼠笼45°倾斜放置24 h、92 dB噪声干扰2 h、夹尾1 min、24 h连续照明、水及食物剥夺24 h、湿垫料24 h。每天选取其中一种刺激，同一刺激不连续进行，共刺激5周。以大鼠直立次数、跨越方格数（旷场实验）及糖水偏爱度（糖水实验）显著降低视为造模成功。应激刺激5周后，银杏内酯B低、中、高剂量组分别按照15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg[7]灌胃给予银杏内酯B，氟西汀组按照10 mg/kg[8]灌胃给予氟西汀，正常对照组及模型组给予等量生理盐水，1 次/d，连续给药6 周[8]。末次给药结束24 h后进行后续实验。

1.4 旷场实验 将大鼠置于40 cm×80 cm×80 cm方形箱内，箱底部用黑色笔划分为25 个小方格，将大鼠逐一放置在箱底中央方格内，通过摄像机记录每只大鼠5 min 内的运动行为，计算大鼠直立次数及跨越方格数。每只大鼠实验结束后清洗方箱内壁及底面，并用70%酒精消毒。

1.5 糖水实验 在每只大鼠的饲养笼中分别放置自来水和10 g/L 的蔗糖水，大鼠适应48 h 后，禁水6 h，再次放置自来水和10 g/L 的蔗糖水，分别记录蔗糖水及自来水的摄入量，计算大鼠糖水偏爱度。糖水偏爱度=蔗糖水摄入量/（蔗糖摄入量+水摄入量）×100%。

1.6 血清IL-1β 和TNF-α 水平测定 大鼠麻醉后，腹主动脉取血，室温静置1 h，离心10 min，取上层血清，采用ELISA 法测定大鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平。

1.7 海马组织PGE2、CAT、SOD及ROS水平测定颈椎脱臼法处死大鼠后，分离大鼠海马组织，在含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中研磨，4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，取上清，采用ELISA 法检测大鼠海马组织中PGE2、CAT、SOD和ROS水平。

1.8 海马组织病理学检查 颈椎脱臼法处死大鼠后，取海马组织，包埋，切片，梯度乙醇脱蜡、水化，行苏木精—伊红（HE）染色，在显微镜下观察各组海马组织病理学改变。

1.9 RT-qPCR 法检测大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 及IL-1β mRNA 相对表达量 用Trizol 提取大鼠海马组织中的总RNA，逆转录为cDNA，使用PCR 试剂盒检测NF-κBP65、TNF-α 及IL-1β mRNA相对表达量，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。PCR 引物序列如下：NF-κBP65 上游：5’-CGGGAATTCTAGATCGTCT-3’，下游5’-GGGGTACCATCTTGGCGTCG-3’；TNF-α 上游：5’-CAACACAAACCCCAAGTCCT-3’，下游：5’-CAGGTTCCTCCTGAGACTGC-3’；IL-1β上游：5’-CCCATGCTGGATATTTGCTT-3’，下游：5’-TCAGGTTCACCCAGTGACAA-3’；GAPDH 上游：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，下游：5’-TGATGGCAACAATGTCCACT-3’。PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.10 Western blotting 法检测大鼠海马组织NFκBP65、TNF-α 及IL-1β 蛋白表达 取大鼠海马组织，加入裂解液，匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清；BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量后，取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜；室温封闭1 h，加入一抗NF-κBP65、TNF-α及IL-1β（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜3 次；经辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST 溶液洗膜3 次。ECL发光液显色，自动曝光，凝胶成像系统拍照，Image J 1.4.0 软件分析条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.11 统计学方法 所有数据使用SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 组大鼠直立次数及跨越方格数比较 给药前，与正常对照组比较，模型组、银杏内酯B各剂量组及氟西汀组大鼠直立次数及跨越方格数均明显减少（P＜0.05）；给药后，与模型组比较，银杏内酯B各剂量组大鼠直立次数及跨越方格数均明显增加（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表1。

表1 6组大鼠直立次数及跨越方格数比较 ，n=12

表1 6组大鼠直立次数及跨越方格数比较 ，n=12

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与银杏内酯B低剂量组比较，aP＜0.05；与银杏内酯B中剂量组比较，bP＜0.05。

2.2 6 组大鼠糖水偏爱度比较 给药前，与正常对照组比较，模型组、银杏内酯B各剂量组及氟西汀组大鼠糖水偏爱度明显降低（P＜0.05）；给药后，与模型组比较，银杏内酯B 各剂量组大鼠糖水偏爱度明显升高（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表2。

表2 6组大鼠糖水偏爱度比较 ，n=12

表2 6组大鼠糖水偏爱度比较 ，n=12

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与银杏内酯B低剂量组比较，aP＜0.05；与银杏内酯B中剂量组比较，bP＜0.05。

2.3 银杏内酯B 对抑郁样行为大鼠血清IL-1β 及TNF-α 水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β 及TNF-α 水平明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，银杏内酯B 各剂量组大鼠血清IL-1β及TNF-α水平明显降低（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表3。

表3 6组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比较 pg/mL，，n=12

表3 6组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比较 pg/mL，，n=12

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与银杏内酯B低剂量组比较，aP＜0.05；与银杏内酯B中剂量组比较，bP＜0.05。

2.4 6组大鼠海马组织PGE2、CAT、SOD 和ROS 水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织PGE2水平和ROS相对水平明显升高，CAT、SOD水平明显降低（均P＜0.05）；与模型组比较，银杏内酯B各剂量组大鼠海马组织PGE2水平和ROS相对水平明显降低，CAT、SOD水平明显升高（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表4。

表4 6组大鼠海马组织PGE2、CAT、SOD及ROS水平比较 ，n=12

表4 6组大鼠海马组织PGE2、CAT、SOD及ROS水平比较 ，n=12

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与银杏内酯B低剂量组比较，aP＜0.05；与银杏内酯B中剂量组比较，bP＜0.05。

2.5 银杏内酯B 对抑郁样行为大鼠海马组织病理改变的影响 正常对照组大鼠海马组织结构正常，细胞排列整齐，细胞核清晰，无明显病理性改变；与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织细胞排列不整齐，海马组织细胞核固缩；与模型组比较，银杏内酯B各剂量组和氟西汀组大鼠海马组织病理形态明显改善，见图1。

图1 大鼠海马组织病理学改变（HE，×400）

2.6 6 组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相对表达量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，银杏内酯B 各剂量组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA 相对表达量均明显降低（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见表5。

表5 6 组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相对表达量比较 ，n=12

表5 6 组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β mRNA相对表达量比较 ，n=12

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与银杏内酯B低剂量组比较，aP＜0.05；与银杏内酯B中剂量组比较，bP＜0.05。

2.7 6 组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β蛋白表达量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，银杏内酯B各剂量组大鼠海马组织NF-κBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表达量明显降低（均P＜0.05），且呈剂量依赖性，见图2。

图2 6组大鼠海马组织NF-κBP65、IL-1β和TNF-α蛋白相对表达量比较

3 讨论

银杏内酯B 是从银杏科植物银杏Ginkgo bilobaL.的干燥叶中提取分离得到的化合物，具有显著的认知功能改善、神经修复和抗神经元细胞凋亡作用[9-10]。刘娜等[11]研究发现，银杏内酯B能够通过调节PI3K/Akt 信号通路，上调HIF-1α 表达，进而修复神经细胞损伤；王军等[12]则报道了银杏内酯B 对缺氧引起的新生大鼠神经元凋亡的抑制作用；张艳艳等[6]研究发现，银杏内酯B 能够通过降低炎症反应并促进血管新生，进而提高大鼠认知功能；万芬等[13]研究发现，银杏内酯B 甲基苯丙胺引起的小胶质细胞活化，并抑制其炎症反应的发生。

抑郁样行为与海马组织损伤、炎症反应和氧化应激等病理性改变有关，其中PGE2、CAT、SOD 和ROS是反应组织细胞氧化应激状态的指标[14]。研究表明，抑郁小鼠海马组织PGE2 水平升高会降低氟西汀的治疗效果[15]。大鼠体内PGE2 水平升高，海马组织CAT 和SOD 水平降低与抑郁样行为的发生有关[16-18]。蔡萧君等[19]研究发现，海马组织ROS 水平升高会导致神经元细胞凋亡，加重大鼠抑郁样行为的发生，而降低海马组织ROS水平则能够显著恢复海马组织氧化应激损伤，改善大鼠抑郁情绪。本研究中，模型组大鼠海马组织PGE2 水平和ROS 相对水平升高，CAT、SOD 水平降低，而银杏内酯B 各剂量组大鼠海马组织PGE2水平和ROS相对水平呈剂量依赖性降低，CAT和SOD水平呈剂量依赖性升高。提示银杏内酯B可能通过抑制海马组织氧化应激促进大鼠抑郁的改善。

NF-κBP65、IL-1β 和TNF-α 是与炎症反应密切相关的指标。NF-κBP65 水平的升高会导致炎症因子诱导的吲哚胺-2,3-过氧化酶的激活，进而导致抑郁的发生[20]。曲苏晨等[21]研究表明，抑制NF-κBP65水平能够促进小鼠抑郁状态的恢复。在抑郁症的发病及进展过程中，血清和组织中IL-1β、TNF-α 水平的升高也起到至关重要的作用。秦淑英等[22]临床研究发现，抑郁症患者体内IL-1β 和TNF-α 水平的升高会导致患者神经细胞因子和单胺类递质代谢异常，加重患者疾病进展，而抑制患者体内IL-1β和TNF-α水平则能够显著改善患者的抑郁症状。赵岳等[23]研究发现，IL-1β和TNF-α水平的升高是导致产后抑郁发生的重要因素，降低IL-1β 和TNF-α 水平有助于改善患者抑郁状态。本研究结果显示，模型组大鼠血清TNF-α 和IL-1β 水平、海马组织NFκBP65、TNF-α 和IL-1β 蛋白表达量显著升高，而银杏内酯B能够呈剂量依赖性地降低抑郁样行为大鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平，同时降低海马组织NFκBP65、TNF-α和IL-1β蛋白表达量。提示银杏内酯B 可能通过降低大鼠全身炎症反应，减少海马组织炎症因子的产生，改善大鼠的病理变化，纠正抑郁行为。

综上所述，银杏内酯B 能够显著降低抑郁样行为大鼠体内炎症反应和氧化应激，抑制大鼠抑郁样行为加重，缓解大鼠抑郁状态。