薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路调节作用研究

黎 艳，王世栋，黄文川

（广西南宁市第二人民医院中西医结合科，南宁 530031）

缺血性脑卒中是临床常见的脑血管病变，其发病机制与年龄、性别等多种因素密切相关。临床表现为运动功能障碍及神经功能损伤，如不及时干预会导致疾病进一步进展恶化，给患者及其家人带来巨大的经济和精神负担[1]。近年来研究发现，TLR4-MyD88/TRIF 信号通路会导致脑组织炎症反应增加，造成神经损伤[2-3]。薯蓣皂苷元是从豆科和薯蓣科植物中提取分离得到的天然产物，现代医学研究表明，其对心脑血管疾病及脑缺血等疾病的治疗具有显著效果[4]，然而，薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中的治疗作用及机制目前尚不十分清楚。本文通过研究薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中的改善作用及机制，为研究薯蓣皂苷元的药理作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

薯蓣皂苷元（成都格利普生物科技有限公司，对照品，纯度＞98%，批号20190921）；尼莫地平（拜耳医药保健有限公司，批号1908051）；Toll样受体-2（TLR-2）（上海信裕生物科技有限公司，货号XYTLR2-Ra）；白介素（IL）-1β、IL-6 及肿瘤坏死因子（TNF-ɑ）试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒、苏木精—伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号SEKR-0002、SEKR-0005、SEKR-0009、PC0020、G1120）；RNA 提取试剂盒、cDNA 提取试剂盒、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGA1202、KGA1316、KGA1028R）；TLR4、MyD88、TRIF 及GAPDH 兔多克隆抗体（赛默飞世尔科技有限公司；货号48-2300、PA5-19919、PA5-106871、PA1-16777）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、RIPA组织裂解液、化学发光试剂盒（碧云天生物科技有限公司，货号A0208、P0013B、P0018M）；PCR 引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.2 设备与仪器

E-Gel Imager 凝胶成像仪（赛默飞世尔科技有限公司）；DB001Morris 水迷宫视频分析系统（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；TGL-16M 台式高速冷冻离心机（北京泰泽嘉业科技发展有限公司）；IX83荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；YD-202石蜡切片机（上海文乐生物科技有限公司）；TB-FL1 石蜡包埋机（武汉天之瑞医疗科技有限公司）；ELx808酶标仪（瑞士Lonza公司）。

1.3 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠72 只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK（湘）2019-0014，饲养于实验动物房，动物房温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h明暗循环。

1.4 造模、分组及给药

72 只大鼠按照随机数字表法分为假手术组（12只）及造模组（60只），参照文献[5]的方法，采用四血管阻断法建立缺血性脑卒中大鼠模型，具体方法：大鼠麻醉后于枕后位沿正中做一切口，在双侧第一横突翼孔下通过椎动脉热凝4 s，24 h后沿颈部切开，分离两侧颈总动脉并使用动脉夹夹闭，20 min后取下动脉夹，逐层缝合伤口。以大鼠在造模后60 s 内出现瞳孔放大、昏迷及翻正反射消失视为造模成功，假手术组大鼠只进行伤口切开及闭合，不进行动脉阻断。造模成功后的大鼠随机分为缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元低、中、高剂量组及阳性对照组，每组12只。按照文献[6]方法分别从运动功能、感觉功能、平衡功能和反射功能对大鼠进行神经功能缺损评分，最低为0分，最高为18分，得分越高，神经功能缺损越严重。薯蓣皂苷元低、中、高剂量组分别按照12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg[7]的剂量灌胃给予大鼠薯蓣皂苷元，阳性对照组按照20 mg/kg[8]的剂量灌胃给予大鼠尼莫地平，假手术组及缺血性脑卒中模型组灌胃给予大鼠生理盐水，1次/d，连续给药21 d[7]。末次给药24 h后，再次对各组大鼠进行神经功能缺损评分。

1.5 大鼠空间记忆能力测定

使用Morris 水迷宫测定大鼠空间记忆能力。将大鼠置于水迷宫，从水迷宫四个象限中点入水，待大鼠爬上逃逸平台后将大鼠取出，连续训练4 d后进行正式实验，记录大鼠从入水至首次爬上逃逸平台的时间，记为逃避潜伏期，并记录大鼠在90 s内穿过平台的次数。

1.6 大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α测定

大鼠经断头法处死后取脑组织，加入4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液，研磨匀浆后，4 ℃，8 000 r/min离心15 min以获得上清液。按照酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明书方法测定脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

1.7 大鼠脑组织病理学检查

大鼠断头法处死后分离脑组织，用石蜡包埋后切成5 μm切片，分别经HE常规染色后，中性树脂封片，在显微镜下进行脑组织病理学检查。

1.8 大鼠脑组织TLR4、MyD88 及TRIF mRNA 水平测定

断头法处死大鼠，分离脑组织，从脑组织中提取总RNA，并逆转录为cDNA，使用RT-qPCR 试剂盒对TLR4、MyD88、TRIF 表达进行分析。结果以GAPDH 为内参，用2-ΔΔCT法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.9 大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF蛋白测定

采用断头法处死大鼠后，取脑组织，使用4 ℃预冷的组织裂解液，加入蛋白酶抑制剂，研磨匀浆，4 °C 条件下，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，采用BCA法定量测定总蛋白。取相当于40 μg蛋白的匀浆液，经电泳分离后，转移至聚偏氟乙烯膜上，在室温下封闭1.5 h，分别使用TLR4、MyD88、TRIF和GAPDH抗体（1∶3 000稀释）在4°C下孵育过夜，使用TBST清洗5次，10 min/次，使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀释）孵育2 h，再次洗膜5次，应用化学发光试剂盒显色后，在凝胶成像仪中成像，通过ImageJ1.8.0软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

1.10 统计学方法

使用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损评分的影响

与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠给药前神经功能缺损评分均明显升高（均P＜0.05），缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组无明显差异（P＞0.05）；给药后，与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠神经功能缺损评分均明显降低（均P＜0.05），见表2。

表2 给药前、后各组间大鼠神经功能缺损评分比较 ，n=12

表2 给药前、后各组间大鼠神经功能缺损评分比较 ，n=12

与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血性脑卒中模型组比较，#P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比较，aP＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比较，bP＜0.05。

2.2 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠空间记忆能力的影响

与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组大鼠逃避潜伏期明显增加（P＜0.05），90 s内穿越平台次数明显减少（P＜0.05）；与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠逃避潜伏期明显降低（均P＜0.05），90 s内穿越平台次数明显增加（P＜0.05），见表3。

表3 大鼠逃避潜伏期及90 s内穿越平台次数比较 ，n=12

表3 大鼠逃避潜伏期及90 s内穿越平台次数比较 ，n=12

与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血性脑卒中模型组比较，#P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比较，aP＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比较，bP＜0.05。

2.3 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α的影响

与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均明显升高（P＜0.05）；与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明显降低（P＜0.05），见表4。

表4 大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α比较结果 ，n=12

表4 大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α比较结果 ，n=12

与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血性脑卒中模型组比较，#P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比较，aP＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比较，bP＜0.05。

2.4 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠脑组织病理变化的影响

假手术组脑组织未见明显病理改变，与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组大鼠脑组织神经元细胞凋亡，炎性浸润，细胞质收缩，核仁明显；与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠脑组织病理学改变明显恢复，见图1。

图1 大鼠脑组织病理改变比较（HE，×200）

2.5 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA的影响

与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组大鼠脑组织TLR4、MyD88 及TRIF mRNA 水平明显升高（均P＜0.05）；与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平明显降低（均P＜0.05），见表5。

表5 大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平比较 ，n=12

表5 大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA水平比较 ，n=12

与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血性脑卒中模型组比较，#P＜0.05；与薯蓣皂苷元低剂量组比较，aP＜0.05；与薯蓣皂苷元中剂量组比较，bP＜0.05。

2.6 薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF 蛋白的影响

与假手术组比较，缺血性脑卒中模型组大鼠脑组织TLR4、MyD88 及TRIF 蛋白水平明显升高（均P＜0.05）；与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF 蛋白水平明显降低（均P＜0.05），见图2。

图2 大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF 蛋白相对表达量比较

3 讨论

研究表明，缺血性脑卒中并在临床中呈现出发病率高、死亡率高及治愈率低等特点，主要采用药物治疗及外科手术治疗等方式[9]，然而治疗效果并不满意，所以对于缺血性脑卒中的治疗药物的研发仍是目前的工作重点。尼莫地平是临床中常用的一种脑血管调节剂，对于脑血管损伤及缺血性脑血管痉挛等具有显著的改善作用[10]，因此本文采用尼莫地平作为阳性对照药物。

薯蓣皂苷元是主要存在于豆科和薯蓣科植物中的物质，田友清等[11]发现薯蓣皂苷元能够通过降低血管壁一氧化氮水平，升高髓过氧化物酶水平等作用进而发挥血管保护作用；宁可永等[12]报道了薯蓣皂苷元能够降低心肌缺血大鼠丙二醛水平，并升高血管超氧化物歧化酶及一氧化氮水平，进而发挥对血管内皮的保护作用。由此可见，薯蓣皂苷元在血管性疾病的治疗中可能具有较大潜力。

神经功能缺损评分及空间定向能力是反映缺血性脑卒中大鼠神经损伤程度的重要指标，神经功能缺损评分及逃避潜伏期增加，90 s 内穿过平台次数减少均提示神经运动功能受损[13]，本实验结果表明，给予大鼠不同剂量的薯蓣皂苷元后，大鼠神经功能缺损评分、逃避潜伏期呈剂量依赖性逐渐降低，90 s内穿过平台次数逐渐增加，提示薯蓣皂苷元能够呈剂量依赖性改善大鼠神经功能，修复大鼠受损的运动功能。在缺血性脑卒中进展过程中TLR4-MyD88/TRIF 通路被激活，导致TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-ɑ 等炎症因子释放增加，导致炎症细胞聚集，毛细血管通透性改变，脑组织出现炎症浸润等病理改变[14]。本实验结果表明，与缺血性脑卒中模型组比较，薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 水平呈剂量依赖性逐渐降低，提示薯蓣皂苷元能够呈剂量依赖性降低脑组织炎症细胞水平，抑制脑组织炎症进展，缓解脑组织炎症浸润等病理性改变，进而修复缺血性脑卒中引起的脑组织损伤。

TLR4-MyD88/TRIF 信号通路在缺血性脑卒中的发生发展中起到关键作用，李灿锥等[15]发现，脑缺血损伤大鼠脑组织细胞TLR4、MyD88 水平显著升高，而抑制脑组织TLR4、MyD88水平则能够明显降低大鼠神经功能损伤评分及脑梗死体积，发挥对脑损伤的修复作用；祝美珍等[16]发现，脑缺血大鼠神经损伤与脑组织TLR4、TRIF水平升高有关，使用清热化瘀Ⅱ号方能够通过抑制脑组织TLR4、TRIF 水平进而缓解大鼠脑组织炎症损伤，修复受损神经。本实验结果表明，给予大鼠薯蓣皂苷元后，大鼠脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA及蛋白水平呈剂量依赖性的明显降低，提示薯蓣皂苷元能够呈剂量依赖性的抑制缺血性脑卒中大鼠脑组织TLR4-MyD88/TRIF 信号通路的激活，进而发挥对缺血性脑卒中神经损伤保护作用。

综上所述，薯蓣皂苷元能够修复缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及神经损伤，抑制脑组织炎症反应，其机制可能与调节TLR4-MyD88/TRIF 信号通路有关。