牛磺酸通过调控AKT/GSK-3β通路抑制结直肠癌细胞侵袭转移

陈春香，万慧芳，李淑英，钟小菊，万福生,*

(1.南昌大学抚州医学院生化与分子生物学教研室，江西 抚州 344000；2.南昌大学医学实验教学中心，江西 南昌 330031；3.南昌大学基础医学院生化与分子生物学教研室，江西 南昌 330006)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高,目前是世界范围内癌症相关死亡的第二大原因[1-2]。近年来由于饮食结构和生活方式的改变，我国CRC的发病率保持了快速上升的趋势，是我国第三大常见恶性肿瘤[3-4]。研究[5-7]表明，CRC高发病率和高死亡率的主要原因是其具有难以控制的持续增殖和侵袭转移能力，最终缩短了患者的生存时间。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是一种独特的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，既是由NF-κb介导的癌细胞生存调节因子，又是多种细胞功能的复杂调节因子，涉及的疾病广泛，包括神经退行性变、炎症、纤维化、非胰岛素依赖性糖尿病及癌症等[8-11]。

最近的研究认为GSK-3β可作为多种不同类型癌症的一个潜在的治疗靶点[12]，在控制癌细胞侵袭和迁移方面发挥重要作用。GSK-3β是AKT/GSK-3β信号通路调控上皮-间质转化(EMT)的关键分子，与结直肠癌的侵袭转移密切相关[13-14]。牛磺酸(Taurine,Tau)是细胞内含量最丰富的游离氨基酸之一，具有较广泛的生理功能及药理作用。我们前期研究表明Tau能诱导结直肠癌细胞凋亡，抑制增殖[15]，但Tau对结直肠癌侵袭转移及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影响如何尚不清楚。本文旨在观察GSK-3β在Tau抑制SW480和HT29细胞侵袭转移中的作用，探讨Tau抑制结直肠癌侵袭转移的作用靶点及分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞系和细胞培养

人结肠癌细胞系SW480、HT29购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。SW480细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养基上，HT29细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，保存于37 ℃，5% CO2培养箱中。

1.2 主要试剂和材料

牛磺酸(Sigma公司)；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、细胞裂解液及二甲亚风(DMSO)均购于Solarbio公司；抗AKT(cat.#40576)多抗购自SAB公司，p-AKT(cat.No.#3787)多抗购自中国上海细胞信息技术有限公司，PTEN单抗(cat.Ab32199),E-cadherin单抗(Cat.Ab1416)，N-cadherin单抗(Cat.Ab18203),Vimentin单抗(Cat.Ab92547)；MMP-2(cat.Ab6302),MMP-7(cat.Ab37150),MMP-9多抗(cat.Ab38898)，β-Catenin多抗(cat.Ab92547),GSK-3β单抗(cat.Ab32391),p-GSK-3β-Ser9(Cat.ab75814)多抗及β-actin多抗(cat.20536-1-AP)均购自Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。CCK8试剂(上海东仁化学科技有限公司)。康宁基底膜基质(356234)购自康宁公司(中国上海)。Transwell小室(8 μmoL)购自Corning公司，JetPRIME转染试剂购自上海英捷生物有限公司。质粒p-EGFP-GSK-3β及空载体p-EGFP-N1购买于上海诺百生物科技有限公司。

1.3 Transwell分析细胞迁移和侵袭实验

Transwell小室细胞迁移实验：收集对数生长期的SW480和HT29细胞，实验分为正常对照组(Control)、4个Tau组(40，80，160，200 mmoL)。将生长良好的细胞用不含血清的培养基处理12 h，然后用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，在不含血清的上室中以1×105/孔的密度放置。Transwell装置下腔填充600μl RPMI 1640或DMEM,DMEM中添加10%胎牛血清，含不同浓度的Tau。培养48 h后，用棉拭子从上孔取出无创细胞，4%多聚甲醛固定20 min,1%结晶紫烘干20 min，洗3次。小室干燥后在倒置显微镜下观察并使用图像采集系统选取上、中、下、左、右5个视野，于100倍光镜下拍照，计数其平均穿膜细胞数。

细胞侵袭实验：将Matrigel胶分别与不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基础培养基按1:8的比例混合均匀。将Matrigel胶和培养基混合好后，取该混合物60 μL铺于已预冷的小室中，将小室置24孔板中，在37℃过夜凝固成胶状。然后接种，接种于小室的细胞数变为2×105个/孔，其余步骤与Transwell小室迁移实验相同，计算平均细胞数，即侵袭细胞数。实验重复3次。

1.4 细胞转染和Tau处理

收集对数生长期的SW480和HT29细胞，实验分为以下5组：①正常对照组(Control)：细胞于37℃、5%CO2正常培养48 h；②Tau(80 mmol·L-1)：加入终浓度为80 mmol·L-1的Tau，正常培养；③空载体对照组(p-EGFP-N1)：转染NC-shRNA后正常培养；④p-EGFP-GSK-3β转染组：转染p-EGFP-GSK-3β，6 h后换液，正常培养48 h；⑤p-EGFP-GSK-3β转染+Tau(80 mmol·L-1)联合处理组：转染p-EGFP-GSK-3β，6 h后换液，加入终浓度为80 mmol·L-1的Tau，培养48 h。转染过程按jetPRIME转染试剂说明书进行，基本步骤如下：将2 μg DNA溶于200 μL的jetPRIME缓冲液中，漩涡震荡混匀。往上述混合液中加入4 μL jetPRIME转染试剂，漩涡混匀10 s，简单地上下颠倒。室温孵育10 min后，每孔加入200 μl的转染复合物到含有完全培养基的细胞中，且分布均匀，并将其放回培养箱中培养48 h，然后进行其他实验。实验重复3次。

1.5 CRC细胞划痕愈合实验

收集对数生长期的SW480和HT29细胞，实验分组与1.4细胞转染和Tau处理相同。用Marker笔在6孔板的外底部横着画4条线，然后收集对数生长期的细胞接种于6孔板中，5×105个/孔，贴壁生长12 h后用10 μL移液器的枪头在6孔板内底部垂直Marker笔的画线而竖直划痕4条；用2 mL PBS洗去悬浮细胞，加入2 mL/孔新鲜培养液并在光学显微镜下拍照(40倍)，以此时为0 h；接着按实验分组，分别加入不同浓度Tau培养处理细胞12 h、24h，在固定时间点，同一条件下拍下划痕照片并记录细胞迁移情况。最后，用Image Pro Plus 6.0软件统计平均值，计算细胞迁移率。细胞迁移率(%)=(0h划痕距离-24h划痕距离)/0 h划痕距离×100%。实验重复3次。

1.6 Western blot检测细胞中蛋白水平

收集经Tau处理48 h的细胞，在冰上用细胞裂解液进行裂解，12 000 r·min-1离心(4℃)10 min，取上清液。采用Pierce BCA ProteinAssayKit试剂盒检测蛋白浓度。按20 μg蛋白上样量将蛋白样品与上样缓冲液(5×)按4:1的体积比例混合，沸水中煮5 min，冷却后上样。经10%SDS-PAGE并半干电泳转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入PTEN、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、Vimentin、β-catenin及MMP2/7等抗体，并4 ℃孵育过夜。次日，在室温下加入二抗孵育2h，ECL化学发光法显色，X线胶片曝光成像，扫描仪扫描蛋白条带。实验重复3次。

1.7 统计处理

所有结果被描述为均数加减标准偏差(SD)。采用SPSS 19.0软件进行双尾配对t检验，以检测各组间测量变量的显著性差异，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Tau对人结直肠癌细胞侵袭和迁移的抑制作用

通过Transwell小室实验检测了SW480和HT29细胞的侵袭和迁移情况(见图1)。结果显示，对照组SW480细胞的侵袭能力明显大于HT29细胞，Tau对SW480和HT29细胞侵袭和迁移的抑制作用均随着药物浓度的增加而增强(P<0.05)。经Tau处理48 h后SW480细胞的侵袭能力也明显比HT29细胞强；

注：a为Tau作用48 h的细胞侵袭结果(n=3)，b为Tau作用48 h的细胞迁移结果(n=3)，c为细胞侵袭统计结果图，d为细胞迁移统计结果图。

2.2 Tau对人结直肠癌细胞PTEN/AKT/GSK-3β通路的影响

为了探讨Tau抑制CRC细胞生长、侵袭和迁移的分子机制，我们观测了Tau对SW480和HT29细胞中PTEN/AKT/GSK-3β通路相关蛋白表达变化(见图2)。结果显示，当Tau作用细胞48 h后，对CRC细胞中PTEN，AKT，p-AKT,GSK-3β及p-Gsk-3β蛋白水平有不同程度的影响，与对照组比较，Tau有一定的浓度依赖性上调SW480和HT29细胞中PTEN,GSK-3β及p-GSK-3β蛋白水平(P<0.05),下调AKT，p-AKT Ser473蛋白水平;在SW480细胞中Tau对GSK-3β，AKT和p-AKT Ser473的作用要大于HT29细胞，而对PTEN和p-GSK-3β的作用要小于HT29细胞。结果提示Tau可提高CRC细胞内PTEN、GSK-3β表达及p-GSK-3β水平，下调AKT，p-AKT Ser473蛋白水平。

注：A为Tau作用48h后SW480细胞结果(n=3)，B为Tau作用48hHT29细胞结果(n=3)；

2.3 质粒转染效果

结果如图3所示，SW480和HT29细胞经转染48h后，p-EGFP-N1和p-EGFP-GSK-3β组细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，而Control组未见荧光，说明这两组有荧光蛋白导入；NC-shRNA组也显绿色荧光，说明有RNA干扰片段导入SW480和HT29细胞中。

注：图左边有绿色荧光蛋白是在荧光显微镜下的结果(显绿色荧光)；右边呈黄色的是普通光镜下结果。

2.4 GSK-3β过表达对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响

为探讨GSK-3β在Tau抑制CRC细胞侵袭和转移中的作用，我们观察了GSK-3β过表达在Tau在抑制SW480和HT29细胞侵袭和转移中的影响。Transwell小室实验结果(见图4)显示，与Control或p-EGFP-NC组比较，Tau组的细胞侵袭和迁移的数量呈显著性减少(P<0.01)；与p-EGFP-NC组相比，p-EGFP-GSK-3β组的细胞侵袭和迁移数量有显著性减少(P<0.01)；与p-EGFP-GSK-3β或Tau组比较，p-EGFP-GSK-3β+Tau组的侵袭和迁移细胞数量有显著性降低(P<0.01)。划痕愈合实验结果(图5)与Transwell小室实验结果基本一致，细胞迁移的能力被GSK-3β显著抑制，但pEGFP-GSK-3β组的划痕愈合速度比Tau组慢；与pEGFP-GSK-3β组比较，pEGFP-GSK-3β+Tau组的愈合速度显著降低(P<0.01)。结果提示GSK-3β能增强Tau对CRC细胞侵袭和迁移的抑制作用。

注：A为SW480细胞的结果，B为HT29细胞的结果；*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs p-EGFP-NC;&P<0.05,&&P<0.01 vs p-EGFP-GSK-3β or Tau 80 mmoL group.Tau的浓度是80 mmoL·L-1，作用时间48 h;n=3

注:A为SW480细胞划痕愈合实验结果(处理48 h)，B为HT29细胞划痕愈合实验结果(处理48 h)，C为SW480细胞统计结果图，D为HT29细胞统计结果图.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs p-EGFP-NC;&P<0.05,&&P<0.01 vs p-EGFP-GSK-3β or Tau 80 mmoL group。

2.5 GSK-3β过表达对EMT、MMPs及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相关蛋白表达的影响

为探讨GSK-3β对SW480细胞中EMT、MMPs及AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相关蛋白表达的作用。我们的实验结果(见图6)发现，与p-EGFP-NC组比较，p-EGFP-GSK-3β组的E-Cadherin、GSK-3β蛋白表达有显著升高(P<0.01)，而N-Cadherin,Vimentin,β-Catenin,MMP2,MMP7和AKT蛋白表达均有显著降低(P<0.01或P<0.05)；与Tau组或p-EGFP-GSK-3β组比较，p-EGFP-GSK-3β+Tau组的E-Cadherin,GSK-3β蛋白表达有显著升高(P<0.01)，而N-Cadherin、Vimentin、β-Catenin、MMP2、MMP7和AKT蛋白表达均有显著降低(P<0.01)。结果表明GSK-3β蛋白能增强Tau抑制SW480细胞EMT过程，下调细胞内MMP2、MMP7及β-Catenin含量。

注：A为Western blotting结果，B，C和D为结果统计处理图；*P<0.05,**P<0.01 vs control;##P<0.01

3 讨论

牛磺酸(又名2-氨基乙磺酸)是一种不用于蛋白质合成的含硫氨基酸，在哺乳动物中被称为半必需氨基酸，主要由肝脏和肾脏产生,是哺乳动物组织中含量最多的游离氨基酸[16]。牛磺酸具有许多基本的生物学作用，它存在于包括视网膜、大脑、心脏和胎盘等不同的器官，对心血管功能、骨骼肌、视网膜及中枢神经系统发育和功能至关重要[17-19]。在人体内各种器官和组织成分中起着重要的生理和病理作用，包括渗透压调节、膜稳定、钙水平的调节、能量代谢、基因表达、抗氧化、抗凋亡、抗炎及抗脂质活性等[20-22]。牛磺酸的抗氧化作用已被发现可以影响细胞增殖、炎症和胶原蛋白沉积。近年来不断有研究表明[23-26]Tau具有较强的抗肿瘤作用，主要表现为诱导癌细胞凋亡、自噬及对化疗药物的增效减毒作用等，但牛磺酸抗肿瘤作用的机制尚未弄清。据报道牛磺酸与顺铂联合应用可下调基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)，抑制胶质瘤细胞侵袭转移，也可抑制前列腺癌EMT过程[23]。本文实验结果显示，牛磺酸不仅对结直肠癌侵袭迁移有抑制作用(图1)，且可提高CRC细胞内PTEN、GSK-3β表达及p-GSK-3β水平，下调AKT，p-AKT Ser473蛋白水平(图2)。结果表明牛磺酸可下调p-AKT Ser473蛋白水平，提高CRC细胞内GSK-3β，而GSK-3β能增强牛磺酸对CRC细胞侵袭迁移的抑制作用(见图4和5)。最近有研究[27]结果显示，在使用偶氮氧基甲烷(AOM)/硫酸钠(DSS)诱导的结肠癌小鼠模型上，牛磺酸能显著提高凋亡标记物、cleaved caspase-9和肿瘤抑制蛋白PTEN的水平，证明牛磺酸在体内有显著降低致癌性的作用。类似研究[28-29]结果是使用二甲基苯[a]蒽(DMBA)诱导的大鼠乳腺癌发生作为乳腺癌模型。给药牛磺酸可显著降低DMBA诱导的大鼠乳腺癌发生率(从80%降至40%)。但牛磺酸在体内是否有抑制癌细胞侵袭迁移的作用，目前罕见有关研究报道。

另有研究结果[30-31]表明，牛磺酸还可以作为一种化学保护剂对抗金属离子Cr(VI)诱导的氧化损伤，并可能被用于缓解这种过渡金属离子的毒性作用；牛磺酸也可以降低赭曲霉素A(OTA)的毒性作用，其机制是牛磺酸通过降低LC3-II蛋白表达和GFP-LC3点的荧光强度来降低OTA诱导的自噬，减少细胞凋亡，维持细胞稳态。简而言之，牛磺酸可缓解OTA诱导的凋亡，抑制pk15细胞自噬，这些作用也与牛磺酸的抗肿瘤作用有关。

GSK-3β属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,最初被描述为一种参与糖原代谢的关键酶。近年来研究发现GSK-3β是一种多功能蛋白，是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)下游作用的主要介质，协调多种细胞内信号，控制细胞对外源性刺激的反应，对细胞内信号通路至关重要，参与多种细胞活动[8]，如调节心肌细胞生长[9]、细胞迁移、葡萄糖代谢调节、炎症反应及细胞凋亡[10]等，GSK-3β是AKT信号传导途径的重要下游靶标，AKT通过Ser473处被磷酸化激活和使GSK-3β失活来促进细胞侵袭转移。PTEN则是AKT的上游信号分子，对AKT起着负调控作用。GSK-3β参与β-catenin的降解，是调节细胞内β-catenin含量、分布和功能的重要因子[32]；胞内β-catenin水平的降低可能是GSK-3β-介导的在β-catenin Ser 33/37和Thr 41上的磷酸化所致，β-catenin的磷酸化形式由蛋白酶体降解的β-TrCP泛素E3连接酶泛素化。GSK-3β的失活会导致胞内β-catenin的累积，促进肿瘤侵袭转移[33]。本文实验结果表明，牛磺酸通过调控AKT/GSK-3β通路，抑制CRC细胞EMT过程和下调MMP2、MMP7及β-Catenin表达，最终抑制CRC细胞侵袭迁移。