基于Wnt通路下调微小RNA-130a对颅脑损伤模型大鼠神经功能的修复作用▲

郑细良 祁占宁 张 亮 方治军 孙智宏

(1 北京市大兴区人民医院神经外科，北京市 100026，电子邮箱：zfpvtr@163.com；2 延安大学咸阳医院神经外科，陕西省延安市 712000)

随着生活节奏的加快，交通事故频繁发生，使得颅脑损伤发生率呈上升趋势，颅脑损伤易导致神经功能缺失，从而影响患者的认知功能，甚至对患者的生命健康产生威胁,严重影响患者生活质量。因此，治疗颅脑损伤时进行神经功能修复尤为重要[1]。Wnt信号通路是在各种生物体中广泛存在的一种保守信号通路，参与调控细胞增殖、分化、迁移以及凋亡等多种过程[2]。颅脑损伤后，损伤部位释放大量的自由基及炎症因子，使得脑细胞进一步坏死，加重病情[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)-130a在颅脑损伤部位高度表达，参与氧化应激及炎症反应损伤的过程[4]。本研究探讨基于Wnt通路下调miRNA-130a的表达对颅脑损伤模型大鼠神经功能的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只SD健康雄性大鼠，购自上海斯莱克公司，许可证号：SYXK(冀)2020-009，月龄7～10 (8.5±0.8)个月，体重220～232 (226.8±3.9)g。在湿度为50%～55%、温度为(24.1±2.1)℃、充足光照(光照12 h/d)的环境下适应性喂养大鼠1周。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 单唾液酸四己糖神经节甘酯钠注射液(齐鲁制药有限公司，国药准字：H20046213)；Wnt3a mRNA、β-联蛋白(β-catenin)mRNA提取试剂盒购自大连Takara生物工程有限公司；miRNA-130a试剂盒由武汉华美生物工程公司提供；兔抗小鼠单抗细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)抗体(艾美捷科技有限公司，批号：A-AO1014a)；小鼠抗小鼠白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α抗体(上海臻科生物科技有限公司，批号：48T96T、AB24781)；小鼠抗小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 、丙二醛、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号：AB24156、AB15874、AB57841、AB26348)。

1.3 方法

1.3.1 分组与建模：大鼠适应性饲养1周后，将大鼠按照随机数字表法分为正常组(10只)和干预组(20只)，正常组不做处理，采用Feeney自由落体硬膜外撞击法[5]对干预组大鼠建立颅脑损伤模型。建模方法为，给予大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)麻醉后，将大鼠头部固定，剪去头颈皮毛，消毒皮肤，沿中线右侧将头皮切开，分离骨膜至颅骨，暴露硬脑膜，再以直径为4.5 mm、重量为25 g的砝码，造成30 cm高空坠落的打击力，使大鼠出现颅脑损伤。建模后大鼠表现出瞳孔缩小、肢体抽搐等症状，即表示建模成功。本实验共有19只大鼠建模成功，将建模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组(9只)和下调miRNA-130a组(10只)。给予下调miRNA-130a组大鼠经尾静脉注射单唾液酸四己糖神经节甘酯钠注射液30 mg/kg，1次/d，共3天，以进行基于Wnt通路下调miRNA-130a的干预[6]，正常组、模型组大鼠每日给予腹腔注射同等剂量的生理盐水。3组大鼠均连续注射7 d。

1.3.2 标本采集：所有大鼠连续干预1周后取心脏血液3 mL，2 000 r/min离心20 min，分离上清液，置于-80℃冰箱保存。腹主动脉采血5 mL后麻醉并断头处死大鼠，分离脑组织，取右侧海马组织于液氮中快速冷冻，置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 苏木精-伊红染色：取大鼠左侧海马区脑组织，4%甲醛固定24 h后行常规石蜡包埋及连续切片，将切片烤干后进行脱蜡处理，之后依次置入不同浓度(95%、80%、70%)的酒精中，3 min/次。使用苏木精染色15 min后清洗3次，30 s/次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用酒精脱水处理后进行脱蜡处理，封片后在显微镜下观察苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色结果。

1.3.4 miRNA-130a、Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相对表达水平的测定：采用实时荧光定量PCR技术法检测miRNA-130a，以及Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA的相对表达水平。首先提取海马细胞总RNA，检测其RNA纯度及浓度后，进行反转录处理，获得cDNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，行PCR扩增,采用Primer Premier 6.0软件设计引物序列，由Invitrogen公司合成引物。引物序列见表1。反应条件为96℃ 6 min；94℃ 15 s、65℃ 45 s，60个循环。以2-△△Ct方法计算miRNA-130a、Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相对表达水平，实验重复3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3.5 大鼠血清中的SOD、丙二醛、IL-6、TNF-α、神经生长因子、BDNF、NSE、MCP-1水平的检测：(1)采用分光光度法检测SOD水平，采用硫代巴比妥酸荧光法测定丙二醛水平。(2)采用酶联免疫吸附测定法检测IL-6、TNF-α及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、BDNF、NSE、MCP-1水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠海马区脑组织HE染色结果 正常组海马区脑细胞排列整齐密集，且细胞大小、形态正常，胞核完整；模型组大鼠海马区脑细胞间隙较宽，细胞肿胀，且神经元萎缩及肿胀，出现核固缩；与模型组比较，下调miRNA-130a组大鼠海马区脑组织的病理改变明显减轻。见图1。

正常组 模型组 下调miRNA-130a组

2.2 3组大鼠海马组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相对表达水平的比较 与正常组相比，模型组、下调miRNA-130a组Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA相对表达水平均升高(P<0.05)；与模型组相比，下调miRNA-130a组Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相对表达水平均降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠海马组织Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相对表达水平的比较(x±s)

2.3 3组大鼠血清SOD、丙二醛水平的比较 与正常组相比，模型组、下调miRNA-130a组的SOD水平降低，丙二醛水平升高(P<0.05)；与模型组相比，下调miRNA-130a组的SOD水平升高，丙二醛水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠血清SOD、丙二醛水平的比较(x±s)

2.4 3组大鼠血清IL-6、TNF-α及MCP-1水平的比较 与正常组相比，模型组、下调miRNA-130a组的IL-6、TNF-α及MCP-1水平均升高(P<0.05)；与模型组相比，下调miRNA-130a组的IL-6、TNF-α、MCP-1水平降低(P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠血清IL-6、TNF-α及MCP-1水平的比较(x±s)

2.5 3组大鼠血清NSE、BDNF及NGF 水平的比较 与正常组相比，模型组、下调miRNA-130a组的NSE水平升高、BDNF及NGF 水平降低(P<0.05)；与模型组相比，下调miRNA-130a组NSE水平降低，BDNF、NGF水平升高(P<0.05)。见表5。

表5 3组大鼠血清NSE、BDNF及NGF 水平的比较(x±s)

3 讨 论

颅脑损伤作为临床上较为常见的一种创伤，常表现为意识障碍、头痛以及呕吐等，给患者的生活带来严重的影响[5]。研究显示，颅脑损伤常导致脑组织缺血缺氧、炎症反应以及神经细胞凋亡等，使得病情进一步发展，引发脑缺血及脑梗死，严重者可导致死亡[6]。多数颅脑损伤患者可出现神经功能障碍，尤其是由钝器或锐器外力所致的颅脑损伤患者，常留有不同程度的神经功能障碍[7]。探寻有效治疗颅脑损伤所致神经功能障碍的方法是临床研究的热点[8]。

Wnt信号通路是神经干细胞增殖分化过程中较为关键的调控通路[9]。正常情况下，Wnt/β-catenin通路表达水平较低，但发生颅脑损伤时该通路将会被激活。其中Wnt3a为Wnt/β-catenin通路的起始蛋白，其表达升高将会激活Wnt信号通路[10]。β-catenin为Wnt/β-catenin通路中的信号转导因子，正常组织细胞中β-catenin以磷酸化的降解复合物形式存在，且含量较低。miRNA在真核细胞中广泛存在，参与各种生理、病理过程[11]。miRNA-130a为miRNA-130具有代表性的因子，研究发现在宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中miRNA-130a均呈高表达，其通过细胞内多个信号通路参与肿瘤细胞的增殖及侵袭过程[12]。研究显示，在颅脑损伤中，下调miRNA-130a相对表达水平，可有效减轻炎症反应及氧化应激，提示下调miRNA-130a的表达可能对颅脑损伤具有保护作用[14]。本研究结果显示，下调miRNA-130a组海马区脑组织病理改变较模型组减轻，且与模型组相比，下调miRNA-130a组的Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA及miRNA-130a相对表达水平均降低(P<0.05)，说明通过Wnt通路下调miRNA-130a能够减轻颅脑损伤模型大鼠的脑组织损伤。

颅脑损伤时氧自由基大量释放，脑组织中的SOD水平下降，丙二醛水平升高[14]。研究显示，在颅脑受到损伤后，氧化应激将会加重脑损伤过程，导致大量氧自由基的产生，进而促进蛋白质氧化、脂质过氧化等，引发脑水肿、颅内压升高的发生[15]。SOD、丙二醛水平或活性高低与氧自由基导致的脑损伤具有密切联系[16]。例如，血清中SOD水平降低会导致脑细胞破坏程度增加，对氧自由基的灭活作用减弱，加剧病情进展；丙二醛水平上升会加剧氧自由基的攻击损害[17]。本研究结果显示，与模型组相比，下调miRNA-130a组的SOD水平升高，丙二醛水平降低(P<0.05)，说明通过Wnt通路下调miRNA-130a的表达水平能够减轻颅脑损伤大鼠的氧化应激水平。

在颅脑损伤患者脑内神经元受损、变性及凋亡的过程中，均有炎症反应的参与，且炎症反应为多种创伤后共有的病理过程。炎症反应能改变颅脑损伤患者血-脑屏障的通透性，使脑血流紊乱，进而加重患者的缺氧、缺血，使脑组织受损程度增加[18]。IL-6为促炎因子,当其水平显著上升时，血管内皮细胞通透性增大，加重继发性脑损伤[19]。TNF-α是活化巨噬细胞的小分子，当其水平过度升高可促进其他炎症因子释放，同时会加剧组织细胞损伤。MCP-1是一种单核细胞特异性趋化因子，在炎症反应中发挥重要作用。本研究结果显示，与模型组相比，下调miRNA-130a组的IL-6、TNF-α、MCP-1水平降低(P<0.05)，提示通过Wnt通路下调miRNA-130a表达水平能够降低颅脑损伤大鼠炎症反应水平。

颅脑损伤常伴有神经损伤，导致患者出现神经功能障碍，影响其生活质量[20]。血清中NSE能反映神经损伤程度，当神经系统受到损伤后，其水平将会显著升高。BDNF与NGF均能够促进神经功能重建。BDNF为神经营养因子家族成员，由脑组织合成，主要分布在脑皮质、纹状体区以及海马区，在神经细胞轴突生长，神经元存活，促进神经康复，抵抗神经细胞凋亡及增加突触可塑性中发挥重要作用[21]。NGF具有促进神经突起生长的生物效应，参与神经系统的发育、分化以及损伤修复等过程[22]。本研究结果显示，与模型组相比，下调miRNA-130a组的NSE水平降低，BDNF、NGF水平升高(P<0.05)，说明通过Wnt通路下调miRNA-130a表达水平能够减轻颅脑损伤模型大鼠的神经损伤程度，促进神经功能修复。

综上所述，基于Wnt通路下调miRNA-130a表达水平对颅脑损伤大鼠进行干预，能够降低炎症反应和氧化应激水平，减轻脑组织损伤，促进神经功能修复。