吴欢生,王飞兵,杨 艳,周光斌,陈 晨,徐田放,周贝怡,陈依婷,薛美佳,曹华斌*
(1.江西省畜禽疫病诊断与防控重点实验室/江西农业大学 动物群发性疾病监测与防治研究所,江西 南昌 330045;2.江西省金溪县农业农村局农业技术推广中心,江西 抚州 344800;3.江西省农业技术推广中心,江西 南昌 330096;4.江西省丰城市农业农村局,江西 丰城 331100;5.厦门海关技术中心,福建 厦门 361000)
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,病毒粒子无囊膜,基因组为单股负链环状DNA,是目前已知最小的动物病毒[1-2]。目前,已发现猪圆环病毒1 型(PCV1)[3],猪圆环病毒2型(PCV2)[1]和猪圆环病毒3 型(PCV3)[4]。2019 年我国首次发现了一种新型PCV,命名为Porcine circovirus type 4(PCV4),随后,国内多个研究团队调查国内各省份(河南、山西、广西、江苏等)均存在PCV4 的流行[5-9]。PCV宿主范围较广,PCV1、PCV2最先在野猪中发现,于2018年证实PCV3可以感染野猪[10-11],可见野猪在圆环病毒感染与传播中起重要作用,那么PCV4能否感染野猪?基于此,本研究采集江西省多个山区野猪组织样品,经PCR 方法检测PCV4,同时扩增阳性样品中的全长Cap 基因,并对其进行同源性及遗传进化分析,为丰富PCV4 的流行病学资料提供实验数据。
1.1 病毒株及样品来源根据PCV4 全基因组序列HNU-AHZ-2019(MN162710)合成PCV4全基因组,并由北京擎科生物科技有限公司合成;25 份野猪组织样品包含7 份淋巴组织、8 份肾脏组织、5 份脾脏组织、5 份大肠组织,采集自江西省不同山区,均来源于不同野猪,样品保存于干冰中运送至江西省畜禽疫病诊断与防治重点实验室-80 ℃保存备用。
1.2 主要试剂2×RapidTagMaster Mix 购自南京诺威赞生物科技有限公司;2×T5 Fast qPCR Mix、DL2000 DNA Marker 及病毒基因组DNA 提取试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司;DNA 回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 引物的设计与合成参照GenBank 中PCV4 基因组序列HNU-AHZ-2019(MN162710)设计一对普通PCR 扩增引物Cap-F/Cap-R(表1),扩增Cap 全长基因;参照文献[6]合成PCV4 特异性探针法qPCR 的探针(PCV4-P)和引物(PCV4F/PCV4R)(表1),引物和探针均由北京擎科生物科技有限公司合成(长沙)。
1.4 样品的qPCR 检测及阳性样品Cap 基因的PCR扩增取少许各组织样品,加入少许无菌PBS,利用组织匀浆机充分打碎匀浆,反复冻融3 次充分释放病毒,12 000 g 离心后,取上清,利用病毒基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA 作为模板,利用表1 中的引物,采用PCV4TaqMan qPCR 方法检测,以无菌双蒸水作为阴性对照,以合成的PCV4 基因组为阳性对照。扩增程序如下: 95 ℃30 s, 95 ℃5 s,共40个循环,60 ℃1 min收集荧光信号。根据上述结果选择3 份阳性样品和部分阴性样品的DNA 经表1 中的引物采用常规PCR 扩增PCV4 Cap 基因,PCR 产物由北京擎科生物科技有限公司测序(长沙)。
表1 本研究所用的引物和探针Table 1 Primers and probes used in this study
1.5 Cap 基因及氨基酸序列的同源性及遗传进化分析采用DNAStar 软件分析本研究获得的野猪源PCV4 Cap 基因序列,并利用DNAStar 软件分析这3 个Cap 基因与22 株圆环病毒Cap 基因的同源性。采用分子遗传进化软件MEG6 构建Cap 基因的进化树并分析其遗传进化关系。
2.1 野猪样品PCV4 的qPCR 检测结果PCV4Taq⁃Man qPCR 法的扩增结果显示,阳性对照扩增出一条特异性S 型曲线,Ct 值为20.365,而阴性对照呈现一条水平直线,无Ct 值,表明该检测方法有效。25 份野猪样品的检测结果显示,其中有3 份样品出现扩增曲线,分别为淋巴结、肾脏和脾脏样品。Ct值分别为26.405、29.211、31.787,其余样品均未出现扩增曲线(图1),阳性率为12%(3/25),表明野猪中存在PCV4 的感染。目前,有关野猪感染猪源病毒的文献较多,野猪可携带或感染多种病原,并造成传播,如猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、PCV 包括PCV1、PCV2和PCV3 等[12-16],本研究首次在野猪组织中检测到PCV4,推测野猪可作为混合器携带并传播多种PCV。
图1 野猪样品PCV4 的qPCR检测结果Fig.1 The detection result of PCV4 from wild boars by qPCR assay
2.2 野猪阳性样品PCV4 Cap 基因的PCR 扩增结果选取上述3 份阳性和8 份阴性样品经常规PCR 扩增,结果显示3份阳性样品均扩增出约1 300 bp的目的条带,其余阴性样品均未扩增出该目的条带(图2),扩增片段位于PCV4 基因组464 nt~1 737 nt,覆盖Cap全长基因。测序结果显示,扩增片段均为PCV4 Cap全长基因,分别命名为JXNC-2020、JXYC-2020及JXGZ-2020,序列上传NCBI 获得登录号分别为MW988110、MW988111、MW988112。本研究首次在野猪组织中扩增并获得PCV4 Cap 基因序列。Zhang 等首次报道PCV4 为环状基因组结构[9-11],直接扩增PCV4 全长基因组较为困难,本研究经多种尝试直接扩增PCV4 全长基因组均未成功,继而选择分段扩增。国内有多个研究团队均是采用PCR 分段扩增方法扩增了家猪源的PCV4 全长基因组[12-16],这可能与PCV4 基因组的特殊结构有关,本研究经PCR 扩增获得了Cap全长基因,Cap蛋白为PCV4的衣壳蛋白,能够诱导机体产生保护性抗体,Cap 全长基因的获得为研究PCV4衣壳蛋白的多样性奠定了基础。
图2 野猪组织样品的PCV4 PCR扩增结果Fig.2 Traditional amplification of PCV4 in wild boars tissues samples
2.3 野猪源PCV4 Cap 基因的同源性分析 同源性分析结果显示,3 个野猪源PCV4 Cap 基因序列之间的同源性为98.69%~100%,氨基酸序列的同源性为97.1%~100%。与GenBank 登录的4 个家猪源PCV4 Cap基因序列的同源性为98.54%~99.13%,氨基酸序列的同源性为97.37%~99.12%,与其中韩国流行株E115 Cap 基因序列的同源性为98.11%~98.54%,氨基酸序列同源性为96.93%~98.25%。野猪源与国内家猪源PCV4 Cap 基因序列的同源性高于其与韩国流行株的同源性。表明野猪源PCV4 与国内家猪源PCV4 亲缘关系更近,推测国内PCV4 可能在家猪与野猪间流行并传播。氨基酸序列分析结果显示,与韩国流行株E115 相比,JXNC-2020 和JXYC-2020 均存在3 个突变氨基酸,分别为R14W、N25S 和K69E;与韩国流行株E115 相比,JXGZ-2020 存在7 个突变氨基酸,分别为R14W、N25S、K69E、L100P、T110I、H137Y 及M211P;与国内家猪源PCV4 相比,野猪源PCV4 Cap 蛋白氨基酸序列的突变数少于其与韩国流行株相比。上述氨基酸突变可能会导致Cap 蛋白的抗原性发生变异。2019年我国首次在家猪检出PCV4,随后韩国也发现PCV4[17]。西班牙和意大利的300 多份野猪样品的筛查结果显示均无PCV4 阳性样品[18]。我国野猪源PCV4与国内家猪源PCV4 Cap 基因序列同源性高于其与韩国流行株的同源性,表明,野猪可能参与了国内PCV4 的流行与传播,也提示野猪可以充当活动载体传播PCV4,且国内家猪、野猪可以互相传播PCV4。
2.4 野猪源PCV4 Cap 基因的遗传进化分析基于圆环病毒Cap 基因的进化树结果显示,22株圆环病毒形成两大分支,野猪源PCV4 Cap基因与12株圆环病毒(包含家猪源PCV4、PCV1、PCV2及蝙蝠相关圆环病毒等)Cap 基因形成一大分支,且与4个家猪源PCV4 Cap基因处于一小分支;PCV3与其他9株圆环病毒(包含犬圆环病毒等)的Cap基因形成另一大分支(图3),进一步表明野猪源PCV4 与家猪源PCV4 亲缘关系较近。
图3 基于Cap基因构建的圆环病毒遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on Cap gene of circovirus
野猪作为重要活动载体,参与了多种猪病病毒的传播与扩散,目前已发现4 种PCV,其中PCV1/2/3均已报道可以感染野猪,本研究首次在野猪中发现PCV4,推测野猪可以作为混合器传播多种PCV,为PCV的流行病学调查及其感染的防控带来新挑战。
总之,本研究首次发现我国野猪存在PCV4 的感染,丰富了PCV4 的自然宿主范围,为进一步理解PCV4 跨物种传播及其感染的防控提供科学依据。