冬凌草素对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤作用机制研究

2022-02-12 03:04韩雨薇陈立刚李晓明梁国标
临床军医杂志 2022年1期
关键词:平衡木脑损伤试剂盒

韩雨薇, 陈立刚, 李晓明, 梁国标

北部战区总医院 神经外科,辽宁 沈阳 110016

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种严重的脑血管疾病,具有较高的病死率与致残率[1]。有研究显示,神经炎症被认为是影响SAH预后的关键因素之一[2]。神经炎性反应涉及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,以及随后的促炎性细胞因子的释放,这可能在SAH后对邻近神经元造成损害[3]。有研究表明,Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)信号通路可能与SAH后的神经炎症有关,而抑制TLR4可能减轻SAH后的认知障碍和继发性脑损伤[4]。冬凌草素是一种二萜类化合物,具有多种生物活性、抗炎、抗肿瘤和抗氧化作用[5]。有研究表明,冬凌草素通过抑制核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)可减轻炎症反应的发生[6]。本研究旨在探讨冬凌草素对SAH后早期脑损伤的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 冬凌草素(纯度>98%,北京索莱宝科技有限公司)、二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司)、TLR4、内参蛋白β-actin、细胞B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)(美国Santa Cruz Biotechnology公司),NF-κB、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine protease-3,caspase 3)。BCA蛋白定量试剂盒、白酶磷酸酶抑制剂、裂解液(Radio-immunoprecipitation assay,RIPA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)配制试剂盒、ECL化学发光试剂盒、TUNEL试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技术公司)、PVDF膜、酶联免疫吸附试验试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验动物及分组 选取96只8周龄SD雄性大鼠为研究对象。体质量280~300 g,来源于北部战区总医院实验动物中心。在标准饲养条件下,恒定温度湿度,给予充足的食物和水。所有大鼠随机分为假手术组、模型组、冬凌草素组,每组各32只。SAH模型制作30 min后,腹腔注射给予药物冬凌草素1次[7],冬凌草素以20 mg/ml溶于二甲基亚砜(methyl sulfoxide,DMSO),在生理盐水中稀释至所需浓度,工作剂量为10 mg/kg。

1.3 研究方法 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉,从颈外动脉端(external carotid artery,ECA)向右侧颈内动脉(internal carotid artery,ICA)插入尼龙缝线,然后在与大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)的分叉处进一步推进3 mm,穿透ICA和MCA的分叉处。假手术组程序相同,但没有刺穿ICA和MCA的分叉处。将基底池分为6个节段,根据出血量的不同,每个区域的评分从0到3分,总分18分[8]。3组大鼠的神经学评估于术后24 h进行。根据神经评分系统评估神经功能缺损[9]。平衡木评分共6个等级。0分:能跳上平衡木,在上面行走不会跌倒;1分:能跳上平衡木,在上面行走跌倒机会小于50%;2分:能跳上平衡木,在上面行走跌倒机会大于50%;3分:在健侧后肢帮助下能跳上平衡木,但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动;4分:在平衡木上不能行走,但可坐在上面;5分:将大鼠放在平衡木上会掉下来。SAH造模后24 h,迅速取出脑组织标本,称量湿重,在105℃下脱水72 h后,再次称量干重。左股静脉注射伊文思蓝染料(2%,5 ml/kg),循环1 h后,用甲酰胺(10 ml/g)浸泡,60℃孵育24 h,测定620 nm处的吸光度。取蛋白质样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,转移到硝酸纤维素膜上,5%BSA在室温下封闭1 h。将膜与一抗抗体孵育4℃过夜。洗涤后,与二抗在室温下孵育1 h。通过增强的ECL发光液检测蛋白条带。采用Western blot法测定大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β表达量。NeuN抗体37℃孵育3 h,加入对应的荧光二抗和TUNEL检测液,37℃避光孵育1 h。

2 结果

2.1 3组大鼠SAH评分、神经功能评分、平衡木评分比较 与假手术组相比,模型组 SAH评分显著增加,神经功能评分与平衡木评分均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,冬凌草素组SAH评分显著降低,神经功能评分与平衡木评分均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠SAH评分、神经功能评分、平衡木评分比较分)

2.2 3组大鼠脑水含量比较 与假手术组相比,模型组左脑、右脑、小脑脑水含量均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,冬凌草素组左脑、右脑、小脑脑水含量均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠脑水含量比较

2.3 3组大鼠伊文思蓝渗出量比较 与假手术组相比,模型组左脑、右脑、小脑伊文思蓝渗出量均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,冬凌草素组伊文思蓝渗出量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠伊文思蓝渗出量比较

2.4 冬凌草素对TLR4/NF-κB信号通路的影响 Western blot结果显示,SAH后TLR4和NF-κB蛋白表达显著增加,而冬凌草素给药能够显著抑制SAH介导的TLR4/NF-κB信号通路激活。见图1。

图1 冬凌草素对TLR4/NF-κB信号通路的影响(a.蛋白电泳结果;b.蛋白表达量比较;c.TNF-α含量;d.IL-1β含量)

2.5 冬凌草素对细胞凋亡的影响 SAH后促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达增加,Bcl-2抗凋亡蛋白表达减少。冬凌草素给药后能够抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。TUENL染色表明,冬凌草素能够抑制SAH诱导的神经元细胞凋亡的发生。见图2。

图2 冬凌草素对细胞调亡的影响(a.蛋白电泳结果;b.蛋白表达量比较;c.TUNEL染色)

3 讨论

早期脑损伤被认为是SAH后最初24~72 h内高病死率与高发病率的重要原因[10]。多种分子机制参与早期脑损伤的病理生理过程,包括炎症、血脑屏障破坏和细胞凋亡[11]。炎症反应包括炎症细胞的活化和促炎因子的释放,在SAH后早期脑损伤的发病机理中起到关键作用。过度的炎症反应会加剧脑水肿、血脑屏障破坏和细胞凋亡[12]。SAH后TLR4/NF-κB信号通路激活,这表明该途径可能为治疗的潜在靶点。TLR4在中枢神经系统中广泛表达,并调节NF-κB的激活。NF-κB的表达调节许多炎症因子的释放,这些细胞因子的上调会加剧SAH后的脑部损伤[13-14]。细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程,在SAH神经元细胞死亡起关键作用。Caspase-3为Caspase半胱氨酸蛋白酶家族的成员,是一种执行凋亡的蛋白质,其数量可以反映凋亡反应的程度。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白,Bax是Bcl2家族的促凋亡成员。Bcl2家族的促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白之间的平衡控制着细胞凋亡反应。炎症反应可加剧细胞凋亡。炎症反应可加剧细胞凋亡。

本研究结果显示,冬凌草素能够增加神经功能评分,减少脑水肿和伊文斯蓝渗出量。这表明,冬凌草素具有改善SAH后的早期脑损伤,保护血脑屏障的作用。冬凌草素能够显著降低SAH后TLR4/NF-κB信号通路的活化,减少IL-1β和TNF-α炎症因子的表达。这表明,冬凌草素能够抑制炎症的发生。此外,冬凌草素可以增加Bcl2的表达,降低Bax和Caspase-3含量。TUNEL染色结果表明,冬凌草素给药可以减轻SAH诱导的神经元细胞凋亡。这表明,冬凌草素具有抗凋亡的保护作用。

综上所述,冬凌草素给药可以在大鼠SAH模型中对早期脑损伤提供神经保护作用。

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