硬毛常山中EHP对人结直肠癌细胞HCT-15增殖和凋亡的影响

吕 典，冷露芬，张 琪，王阿英，赖 祺，易春蝶，马燕华，尹俊林，曾广智

(云南民族大学 民族医药学院，民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室,云南 昆明 650500)

结肠癌(colorectal canser，CRC)是全球第3大常见癌症，其死亡率居全球第2[1].目前有效的诊断方式和治疗措施使结直肠癌的发病率和死亡率得到了下降[2-3]，但术后5年生存率仍小于50%[4]，且患者发病率呈年轻化趋势[1]，严重威胁到人们的生命健康.所以探索结肠癌治疗方法和开发结直肠药物仍具有重要意义.

常山属(DichroaLour.)植物属于虎耳草科的小属，共有12种，分布从亚洲南部大陆到太平洋岛屿，其中有6种存在我国华南和印度[5].常山属植物主要含有生物碱[6]、香豆素[6]、多酚[7]和甾体[8]等成分，具有抗疟疾[9]、抗病毒[10]和抗肿瘤[11]等生物活性.目前对于硬毛常山(DichroahirsutaGagnep.)的研究相对较少，本研究从硬毛常山中分离得到的化合物(E)-6-(4-羟基苯基)-庚-3-烯-2-酮(EHP)化学结构图见图1.发现其对人结直肠癌细胞HCT-15具有较好的增殖抑制活性，探讨了其对人结直肠癌HCT-15的增殖抑制作用和机理，发现EHP主要通过细胞周期阻滞，诱导HCT-15细胞的凋亡，抑制了人结直肠癌HCT-15细胞增殖.

图1 EHP化学结构图

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人宫颈癌细胞Hela、人结直肠癌细胞HCT-15、人乳腺癌细胞MDA-MB-231(中科院昆明植物所)；RPMI 1640、DMEM、胰酶、PBS(BBI，中国)；0.4%结晶紫(索莱宝，中国)；台盼蓝试剂盒(碧云天，中国)；RIPA裂解液、凋亡试剂盒、周期试剂盒(翊圣，中国)；CDK1、CDK2、CDK4、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1、P53、P27、P21、PARP 1、cleaved PARP 1、Caspase 9、active Caspase 9、Caspase 3、active Caspase 3、GADPH和β-actin(Proteintech，中国).3425型二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific，美国)；垂直电泳仪(Bio-rad，美国)；TS-2000A摇床(Kulin-bell，中国)；SpectraMax i3x型微孔板检测器(Molecular Devices，美国)；DMIL LED型倒置显微镜和DMI8型荧光倒置显微镜(徕卡，德国).

1.2 细胞培养

Hela和MDA-MB-231用含有10%FBS的DMEM培养基，HCT-15用含有10%FBS的RPMI 1640培养基，于 37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养.根据不同细胞生长情况、传代数量及细胞状态约 3 d 传代一次，以维持细胞良好生长状态.

1.3 SRB检测细胞增殖

取对数生长期的Hela、HCT-15和MDA-MB-231细胞以5×103个/孔，铺于96孔板，37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱培养 24 h.按照4、20、100 μmol/L 浓度配制EHP，加入96孔板中，每个浓度设置3个复孔，同时设置空白和DMSO溶剂对照，继续培养 48 h.加入50%TCA固定细胞1h，洗板，晾干，4%SRB染色 0.5 h，洗板，晾干，加入 4 mmol/L Tris溶液，摇床 5 min，515 nm 多功能酶标仪检测吸光度，根据结果计算细胞活力.

1.4 台盼蓝染色

取对数生长期的HCT-15细胞以1.2×105个/孔铺于12孔板，37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱培养 24 h.按照10、20、50 μmol/L 浓度配制EHP，加入12孔板，同时设置空白对照，继续培养 24 h.收集细胞，台盼蓝以浓度0.4%重悬细胞，染色 3 min，血细胞计数板计数或拍照，计算细胞存活率.

1.5 平板克隆

取对数生长期的HCT-15细胞以200个/孔，铺于12孔板，37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱培养约 3 d，直至形成肉眼可见细胞团.按照10、20、50 μmol/L 浓度配制EHP，加入12孔板，同时设置空白对照，继续培养 10 d.收板，加无水乙醇固定 15 min，0.4%结晶紫染色 5 min，显微镜下观察，并用相机拍照.

1.6 细胞周期和Western blot实验

取对数生长期的HCT-15细胞以1.2×105个/孔，铺于12孔板，37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱培养 24 h.按照10、20、50 μmol/L 浓度配制EHP，加入12孔板，同时设置空白对照，继续培养 24 h.收细胞，70%乙醇固定细胞过夜，PI染色，37 ℃ 孵育 30 min，流式细胞仪检测.

收集HCT-15细胞，RIPA裂解液冰上裂解细胞，按比例加入5×loading buffer.将各蛋白上样于10%SDS-PAGE中进行电泳，PVDF膜湿法转印.5%脱脂奶粉室温封闭 2 h.2%脱脂奶粉稀释一抗CDK1(1∶3 000)、CDK2(1∶4 000)、CDK4(1∶3 000)、Cyclin A2(1∶4 500)、Cyclin B1(1∶3 500)、Cyclin D1(1∶3 000)、Cyclin E1(1∶3 000)、P53(1∶3 000)、P27(1∶3 000)、P21(1∶3 000)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 过夜孵育，TBST洗膜，2%脱脂奶粉稀释二抗(1∶7 000)室温下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化学发光反应液显影，于化学发光显影仪检测蛋白条带，同时进行半定量灰度分析.

1.7 凋亡和Western blot实验

取对数生长期的HCT-15细胞以1.2×105个/孔，铺于12孔板，37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱培养 24 h.按照 100 μmol/L 终浓度配制EHP，40 μmol/L 终浓度配制凋亡抑制剂Z-VAD-FAM，5 μmol/L 终浓度配制喜树碱(CPT)，各组分别以 100 μL EHP、50 μL EHP+50 μL Z-VAD-FAM、100 μL CPT体积加入12孔板，同时设置空白对照，继续培养 24 h.收细胞，V-FITC和PI染色，室温、避光孵育 15 min，流式细胞仪检测.

收集HCT-15细胞，RIPA裂解液冰上裂解细胞，按比例加入5×loading buffer.将各蛋白上样于10%SDS-PAGE中进行电泳，PVDF膜湿法转印.5%脱脂奶粉室温封闭 2 h.2%脱脂奶粉稀释一抗PARP 1(1∶4 000)、cleaved PARP 1(1∶3 000)、Caspase 9(1∶3 500)、active Caspase 9(1∶3 000)、Caspase 3(1∶3 000)、active Caspase 3(1∶2 500)、GADPH(1∶15 000)和β-actin(1∶15 000)于 4 ℃ 过夜孵育，TBST洗膜.2%脱脂奶粉稀释二抗(1∶7 000)室温下孵育 2 h，TBST洗膜.最后，ECL化学发光反应液显影，于化学发光显影仪检测蛋白条带，同时进行半定量灰度分析.

1.8 统计学分析

统计学分析使用GraphPad Prism 8软件进行，3次独立重复实验，以平均值±标准差表示，采用单因素One-way ANOVA检验分析2组间显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.000 1.

2 结果

3次独立重复实验，以平均值±标准差表示，采用单因素One-way ANOVA检验分析2组间显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001.

2.1 EHP抑制结直肠癌细胞增殖

SRB实验检测EHP对Hela、HCT-15和MDA-MB-231细胞增殖活力，与对照组相比，EHP在20、100 μmol/L 浓度下，显著抑制细胞增殖，在 4 μmol/L 浓度下没有明显的抑制作用(图2A)，根据不同浓度下细胞抑制率，计算出EHP对Hela、HCT-15和MDA-MB-231细胞作用 48 h 时，IC50分别为21.67±1.49、13.61±0.71、25.67±1.33 μmol/L，可以得出其对人结直肠癌HCT-15抑制效果最明显.

对不同EHP摩尔浓度下的HCT-15进行台盼蓝染色(图2B)，随着EHP摩尔浓度的增加，细胞数量减少，且皱缩.对平板克隆结果进行观察(图2C)，发现细胞集落随着EHP摩尔浓度增加减少，且形成集落中细胞数量也明显减少.这些结果说明EHP以摩尔浓度依赖性抑制HCT-15细胞的增殖.

图2 EHP对HCT-15的增殖抑制影响

2.2 EHP诱导HCT-15细胞G2阻滞

流式细胞仪检测不同浓度EHP作用下，HCT-15周期各个时期变化(图3A和3B)，3次独立重复实验,以平均值±标准差表示,采用单因素One-way ANOVA检验分析2组间显著性差异,*表示p<0.05,**表示p<0.01.与对照组相比，随着EHP浓度增加G1期减少，S期整体呈下降趋势，G2明显增加(表S1)，说明EHP诱导HCT-15阻滞在G2期.此外，EHP促进HCT-15细胞中CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表达，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表达(图3C和D)，进一步说明了EHP抑制HCT-15细胞增殖发生G2期阻滞.

图3 EHP对HCT-15细胞周期的影响

2.3 EHP诱导HCT-15细胞凋亡

流式细胞仪检测 100 μmol/L EHP作用下，HCT-15细胞凋亡情况(图4A和4B)，3次独立重复实验,以平均值±标准差表示，采用单因素One-way ANOVA检验分析两组间显著性差异,*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001,****表示p<0.0001.与空白对照组相比，细胞凋亡明显，这与阳性药CPT作用结果相同；加入凋亡抑制剂Z-VAD-FAM，EHP作用下的HCT-15凋亡得到缓解，结果说明Z-VAD-FAM凋亡抑制剂发挥了抑制HCT-15的凋亡作用，进一步证明了EHP诱导了HCT-15的凋亡作用.此外，WB检测结果(图4C和4D)显示，EHP抑制PARP1、Caspase 3、Caspase 9蛋白的表达，促进cleaved PARP1、active Caspase 3、active Caspase 9蛋白的表达，且浓度较高时增强和抑制效果均更为显著，这些实验说明EHP诱导人结直肠癌HCT-15细胞发生凋亡.

图4 EHP对HCT-15细胞凋亡的影响

图5 EHP对HCT-15细胞中P53通路的影响

2.4 EHP抑制p53通路蛋白表达

Western blot检测发现不同浓度EHP下调细胞周期上游调控因子P53、P27和P21的表达，并且呈现浓度依赖性(见图5)，3次独立重复实验,以平均值±标准差表示,采用单因素One-way ANOVA检验分析2组间显著性差异,*表示p<0.05,**表示p<0.01. 说明EHP可能通过影响P53通路的表达，抑制细胞周期，从而抑制细胞增殖.

3 讨论

结直肠癌是我国常发的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁的人们生命安全.手术和放化疗等医学治疗方式的不断发展，使结直肠癌致死率得到缓解[2-3].然而复发率仍然很高，化疗耐药性是其复发的一个主要原因[12-13].因此寻找结直肠癌治疗的其他药物显得尤为重要.硬毛常山属于常山属，关于其报道相对较少，本课题组前期研究发现硬毛常山中单体化合EHP具有较好的抗肿瘤效果，特别是可以显著抑制人结直肠癌细胞HCT-15的增殖.本研究发现，EHP能抑制HCT-15细胞中P53通路蛋白表达，促进CDK1、CDK2、Cyclin B1和Cyclin E1蛋白表达，抑制CDK4、Cyclin A2、Cyclin D1蛋白表达，使细胞周期阻滞在G2期，同时诱导其凋亡.

细胞周期调控着细胞的增殖、复制和分裂进程，主要有3个调控点：G1到S期、S到G2期和G2到M期，分别受不同的基因和蛋白调控[14].细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)通过使周期蛋白磷酸化而形成复合物，其中形成CDK4/6-Cyclin D1复合物在G1期进程中起着至关重要的作用，在G1后期到S期CDK2-Cyclin E1/A2复合物是必须的，而CDK1- Cyclin B1复合物主要在G2期发挥作用.有报道呋喃二烯酮诱导RKO和HT-29细胞G0/G1期阻滞，主要通过降低CDK4、CDK6、Cyclin D1、CDK2和Cyclin E1，伴随着P21上调实现的[15].在本实验中，在EHP作用下，HCT-15肿瘤细胞G1期和S期比例下调，同时检测到CDK2和Cyclin E1蛋白表达增强，而CDK4 和Cyclin D1表达被抑制，并且与CDK2具有结合作用的 Cyclin A2表达也是减弱.在本实验中，同时发现EHP促进HCT-15细胞中CDK1和Cyclin B1蛋白表达，综合以上结果表明EHP诱导HCT-15细胞发生G2期阻滞.

P53是重要的抑癌基因，是周期检测途径中关键性的蛋白[16]，P53的激活可能导致G1或G2期阻滞.研究表明，P53缺乏(突变或缺失)能诱导G2/M期阻滞，并且在P53缺失的细胞中，其作用途径从P21依赖转变成Chk依赖[17-19].CDK相互作用蛋白1(P21)和激酶抑制蛋白1(P27)属于调节细胞周期进程的CIP/KIP蛋白家族[20-21].研究发现当P21表达被阻滞时，地西他滨诱导细胞G2期阻滞[22].P27和P21一样可以与CCND1-CDK4/6复合物相互作用[23]，但是会造成对CCNE-CDK2复合物抑制的阻断[24].在本实验中，EHP抑制肿瘤细胞HCT-15中突变P53的表达，同时导致P21和P27的表达降低，从而促进CDK2、Cyclin E1、CD1和Cyclin B1的表达，G1含量降低，诱导G2期阻滞.但CDK4和Cyclin D1蛋白表达却下降，可能存在其他调节作用.

细胞凋亡是1种细胞程序性死亡，主要包括两种途径：死亡受体介导的凋亡途径和线粒体介导的凋亡途径[25].Caspase 9是细胞凋亡的发起者，充当调节细胞凋亡的多种蛋白激酶信号传导途径的焦点；Caspase 3 是细胞凋亡的主要执行者，多种凋亡刺激因子启动不同的蛋白酶切割Caspase 3，使其激活，活化的Caspase 3进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联反应放大，细胞走向凋亡；PARP是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶(caspase)的切割底物，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用.有研究发现Oridinin以剂量依赖性活化Caspase 3，Caspase 9和PARP-1的切割，从而促进口腔鳞状细胞癌的凋亡[27].在本实验中，不同浓度EHP作用下，HCT-15发生凋亡作用，这与阳性药CPT效果一致，同时用Caspase凋亡抑制剂Z-VAD-FMK进行凋亡抑制，EHP诱导凋亡得到缓解.接着检测得出凋亡相关蛋白PARP 1、Caspase 9和Caspase3表达量均下降，且cleaved PARP、Caspase 9和Caspase 3 活性蛋白含量增加.说明EHP通过激活Caspase 9，从而进一步激活Caspase 3，在体内，PARP 1经Caspase 3剪切失去活性，无法对DNA进行修复，从而导致细胞稳态失衡，细胞发生凋亡.

综上所述，本研究通过对硬毛常山中提取的单体化合物EHP进行抗结直肠癌HCT-15的研究，发现EHP通过调节P53通路，诱导HCT-15发生G2阻滞和凋亡作用，抑制增殖.该研究结论为(E)-6-(4-羟基苯基)庚-3-烯-2-酮(EHP)在结直肠癌中的作用机制以及新的治疗药物开发提供了新的理论资料.